Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave, sullo sviluppo di biofilm, come come identificare le condizioni ambientali chiave, che influenzano la crescita del biofilm e le caratteristiche comportamentali durante lo sviluppo. Il principale vantaggio di questa tecnica, è che le piastre microli fluidiche multicanale consentono la rapida acquisizione di risultati statisticamente significativi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla struttura del biofilm, può anche essere applicato allo studio dei trattamenti antibiotici e alla biorimediazione.
In generale, gli individui nuovi a questo metodo faranno fatica, perché è necessaria un'attenta attenzione ai dettagli del protocollo e competenze meticolose. Per evitare un errore di connessione dello strumento al software, accendere prima la stazione di lavoro del PC, seguita dal modulo di fluorescenza. Assicurarsi che l'otturatore a fluorescenza sia accendente e accendere i controller hardware.
Quindi, accendere il controller del sistema di imaging e la fotocamera CCD. Quindi accendi la stazione di imaging. Quando tutta l'apparecchiatura è pronta, avviare l'applicazione di controllo e inserire il numero di targa, situato sull'etichetta sul lato della piastra.
Per l'adescamento, rimuovere prima la piastra microli fluidica a 48 po po' dalla confezione, senza toccare la superficie del vetro nella parte inferiore della piastra, e pulire lo scivolo di vetro sul fondo della piastra, con un tessuto dell'obiettivo. Per innescare i canali microli fluidici, pipettare 200 microlitri di 37 gradi celsius mezzo minimo nell'uscita bene, facendo attenzione ad evitare bolle. Quindi posizionare la piastra sul palco della piastra.
Pulire l'interfaccia con l'etanolo, sigillarlo sullo stadio della piastra una volta che l'etanolo si è asciugato. In modalità manuale sul modulo di controllo, impostare il fluido come brodo Luria-Bertani a 37 gradi celsius e max pura come cinque dym per centimetro quadrato. Fare clic sui pozzi di uscita per attivare il flusso dall'uscita al pozzo di ingresso, per innescare i canali.
Dopo cinque minuti, mettere in pausa il flusso per prepararsi alla semina e rimuovere con cura la piastra dal palco. Quindi, aspirare bene qualsiasi mezzo residuo dall'uscita senza rimuovere alcun mezzo dal cerchio interno che porti ai canali microli fluidici. Per seminare i canali sperimentali, aggiungere 300 microlitri di mezzo minimo nel pozzo di ingresso, seguito dall'aggiunta di 300 microlitri di coltura batterica, nel pozzo di uscita.
Riportare la piastra alla fase di imaging assicurandosi di pulire l'interfaccia con l'etanolo prima di posizionarla sulla piastra e utilizzare il feed della fotocamera dal vivo per concentrarsi su un singolo canale. Durante il monitoraggio visivo del feed live, riprendere il flusso a 1-2 dym per centimetro quadrato per circa 2-4 secondi, Per consentire alle celle di entrare nel canale sperimentale ma non nei canali serpentini, e lasciare la piastra sullo stadio a temperatura controllata per un'ora, per consentire alle celle di attaccarsi. Alla fine del periodo di attacco, rimuovere con cura la piastra dallo stadio e aspirare bene i batteri dall'uscita senza disturbare il canale.
Quindi, utilizzare una nuova punta di pipetta per rimuovere il supporto dai pozzi di ingresso. Nel software, apri l'acquisizione multidimensionale per controllare l'acquisizione dell'immagine del microscopio e seleziona il time lapse, le posizioni a più fasi e le lunghezze d'onda multiple. Nella scheda salvataggio creare un nome di base semplice, assicurandosi che il nome di base, se presente, sia selezionato.
Includere tutti i dettagli essenziali dell'esperimento nella descrizione. Fare clic su seleziona directory, per selezionare la cartella in cui verranno salvati tutti i file Nella scheda Time Lapse, regolare la durata del tempo sperimentale, su 24 ore, e impostare l'intervallo di tempo per acquisire immagini ogni cinque minuti durante l'esperimento. Usa l'alimentazione della fotocamera dal vivo e l'obiettivo 10x per impostare le posizioni del palco, concentrandosi sul centro del canale, situato sopra o sotto i numeri di canale incisi sulla lastra.
Passa all'obiettivo 20x e individua l'area di visualizzazione e il piano focale ottimali all'interno del canale. Aggiungere quindi la posizione del palco all'elenco con le nuove impostazioni. Sotto il menu delle lunghezze d'onda, impostare il numero di lunghezze d'onda su 3 e impostare la prima lunghezza d'onda sulla fotocamera FITC al 100%, con un tempo di esposizione di dieci millisecondi, la seconda lunghezza d'onda sul campo luminoso 50% fotocamera 50% visibile, con un tempo di esposizione minimo di 3 millisecondi e la terza lunghezza d'onda a tutti chiusi, quindi nessuna luce rimane sull'ultimo canale tra i tempi di acquisizione.
Nel menu modifica esecuzione automatica aprire la scheda di configurazione del protocollo e impostare un nuovo protocollo con una durata di 24 ore con il flusso impostato nella direzione in avanti alla velocità di taglio sperimentale appropriata. Fare clic su Aggiungi e salva con nome per salvare il protocollo e aprire la scheda di configurazione della sequenza. Per impostare una nuova sequenza, selezionate brodo Luria-Bertani a 37 gradi, come fluido predefinito per tutti i canali.
Sotto l'iterazione del passaggio 1 per i canali da 1 a 12, selezionare il protocollo con la prima velocità di taglio sperimentale e abilitare tutti i canali. Per i canali da 13 a 24, selezionare il protocollo con la seconda velocità di taglio sperimentale e abilitare tutti i canali. Quindi selezionate Applica (Apply) e Salva con nome (Save As), per salvare la sequenza e aprite il menu Esecuzione automatica (AutoRun) per selezionare la sequenza salvata da utilizzare per l'esecuzione automatica.
Per impostare l'esperimento del biofilm di crescita tempormente, aggiungere fino a 1300 microlitri di mezzo minimo sterile nel pozzo di ingresso della piastra microli fluidica e riportare la piastra allo stadio di imaging. Quindi, pulire l'interfaccia con l'etanolo e sigillare la piastra. Verificare che i protocolli e le sequenze siano impostati correttamente.
Selezionare Start, per avviare AutoRun, quindi fare clic immediatamente su acquire per avviare la raccolta di immagini al microscopio. Al termine della prima acquisizione dell'immagine, fare clic su Pausa e selezionare la modalità immagine dal vivo nella lunghezza d'onda del campo luminoso. Selezionare Vai a per visualizzare ogni posizione della fase e selezionare Imposta su corrente per impostare le nuove impostazioni.
Quindi, fare clic su riprendi, prima di iniziare l'acquisizione pianificata successiva. In questo esperimento rappresentativo di crescita del biofilm a tempo, la copertura del biofilm, o superficie di soglia percentuale, era diversa per tutte e tre le impostazioni di taglio, indicando che la cesoia aveva un'influenza diretta sulla copertura superficiale del biofilm. La misurazione relativa totale dell'accumulo di biofilm è aumentata in funzione del tempo, con il tasso di crescita che è diminuito dalla sollecitazione di taglio più elevata alla sollecitazione di taglio più bassa.
In ogni condizione, vi è stato anche un chiaro periodo di crescita esponenziale da cui è stato possibile calcolare un tasso di crescita quantitativo. Nel complesso, il coefficiente di rugosità è diminuito nel tempo in tutte le condizioni di taglio, indicando che tutte le superfici del biofilm sono diventate più lisce. Tuttavia, rispetto al taglio più basso, le impostazioni di taglio più elevate hanno portato a una superficie più liscia nel tempo, indicando che un flusso di taglio più veloce contribuisce a una superficie più liscia e uniforme.
Inoltre, l'entropia materale, o la casualità nella morfologia, aumentò nel tempo per tutte le condizioni di taglio. Durante l'esecuzione di questa procedura è importante ricordare di seguire la sequenza specificata e di prendersi il tempo necessario per eseguire ogni passaggio con precisione. Le abilità necessarie possono richiedere alcune corse per padroneggiare.
Seguendo questa procedura, altri metodi come HBLC o GCMS, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sulle concentrazioni di sottostraights, come il glucosio, consumate. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dei biofilm per esplorare ambienti di flusso generale in tempo reale con condizioni sperimentali controllate e campionamento idroterapetico. Non dimenticare che lavorare con ceppi batterici BSL2 può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare dispositivi di protezione adeguati e utilizzare protocolli di scarto appropriati dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
