Le cellule plasmatiche sono cellule rare con 30 fasi di differenziazione che si svolgono in luoghi anatomici che compromettono la piena caratterizzazione biologica, in particolare nell'uomo. Il nostro modello di differenziazione delle cellule plasmatiche B2 in vitro riproduce la differenziazione sequenziale delle cellule e la maturazione che si verificano nei diversi organi in vivo. Questo modello in vitro riassume i cambiamenti trascrizionale coordinati e il fenotipo dei diversi stadi delle cellule plasmatiche B2 che possono essere rilevati in vivo.
Abbiamo anche creato uno strumento bioinformatico ad accesso aperto per analizzare le informazioni più importanti dai dati di esplorazione relativi alla differenziazione delle cellule plasmatiche. A dimostrare la procedura sarà Hugues de Boussac, un postdoc del mio laboratorio. Per iniziare, ottenere cellule del sangue periferiche da volontari sani per la purificazione cellulare della memoria B.
Diluire 7,5 millilitri di sangue con 24,5 millilitri di mezzo RPMI 1640. Successivamente, aggiungere 12,5 millilitri di gradiente di densità a temperatura ambiente a un tubo conico sterile da 50 millilitri. Sovrapporre delicatamente il gradiente di densità con i 32 millilitri di sangue diluito, assicurandosi di ridurre al minimo la miscelazione delle due fasi.
Centrifugare per 20 minuti a 500 volte la gravità con il freno spento. Raccogliere le cellule mononucleari del sangue periferico dall'interfaccia del plasma diluito e del gradiente di densità. Trasferire le cellule in un tubo sterile da 50 millilitri e riempire il tubo fino a 45 millilitri con la soluzione di sale bilanciato di Hank.
Centrifuga a 500 volte la gravità per cinque minuti. Rimuovere con cura il supernatante e conservare il pellet. Quindi, aggiungere 45 millilitri di mezzo RPMI 1640, integrati con il 10%FCS.
Centrifuga a 500 volte la gravità per cinque minuti. Rimuovere con cura il supernatante e conservare il pellet. Aggiungere 30 millilitri di PBS, integrati con il 2%FCS.
Utilizzare perline magnetiche anti-CD per rimuovere le cellule cd2 positive aggiungendo quattro perline per una cella di destinazione. Incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzando un magnete per l'applicazione della separazione cellulare, separare le cellule legate al tallone dalle celle non associate.
Raccogliere le cellule non unite e incubarle con anticorpi anti-CD19 APC e anti-CD27 PE per quindici minuti a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule due volte in PBS contenente il 10% di siero di capra. Utilizzare quindi lo smistatore di celle per purificare le celle della memoria B con una purezza del 95%.
Successivamente, aggiungere ligando CD40 solubile e anticorpo monoclonale anti-poliistidina per l'attivazione delle cellule B della memoria. Placcare le cellule B della memoria purificata in piastre di coltura a sei pozzi per quattro giorni con interleuchina-2, interleuchina-10 e interleuchina-15. Per la profilazione dell'espressione genica, usa uno smistatore di cellule per purificare i preplasmablasti CD38-negativi CD20-negativi al quarto giorno.
Il quarto giorno, conta le cellule e placcale in piastre di coltura di 12 pozzetti ad una densità cellulare di 250.000 cellule per millilitro aggiungendo due millilitri di sospensione cellulare in ogni pozzo. Per indurre la differenziazione, rimuovere gli oligonucleotidi CPG e il ligando CD40 solubile e aggiungere un nuovo mezzo di coltura contenente un nuovo cocktail di citochine tra cui interleuchina-2, interleuchina-6, interleuchina-10 e interleuchina-15. Coltura delle cellule per tre giorni a 37 gradi Celsius.
Per la profilazione dell'espressione genica, usa uno smistatore di cellule per purificare i plasmablasti CD38 positivi, CD20 negativi al settimo giorno. Il settimo giorno, conta le cellule. Placcare le cellule in piastre di coltura di 12 porcile a una densità cellulare di 500.000 cellule per pozzo, aggiungendo due millilitri di sospensione cellulare ad ogni pozzo.
Differenziare i plasmablasti in prime cellule plasmatiche usando un mezzo di coltura fresco contenente interleuchina-6, interleuchina-15 e interferone-alfa per tre giorni a 37 gradi Celsius. Per la profilazione dell'espressione genica, utilizzare uno smistatore di cellule per purificare le cellule plasmatiche precondo cd20 negative, CD38 positive, CD138-positive al giorno 10. In primo luogo, coltura cellule stromali per cinque giorni con mezzo di coltura.
Utilizzare un filtro da 0,2 microliter per filtrare il supernatante di coltura cellulare stromale per ottenere un mezzo condizionato della cella stromica e congelare fino a quando non è pronto per l'uso. Successivamente, coltura le prime cellule plasmatiche in piastre di coltura a 12 pozzi, usando il mezzo cellulare stromale precedentemente ottenuto con interleuchina-6 e APRIL ad una densità cellulare di 500.000 cellule per pozzo, aggiungendo due millilitri di sospensione cellulare ad ogni pozzo. Incubare a 37 gradi Celsius, rinnovando il mezzo condizionato della cellula stromale ogni settimana.
Quindi, misurare la secrezione di immunoglobulina dalla citometria del flusso ordinata cellule plasmatiche. Coltura delle cellule plasmatiche ad una densità di un milione di cellule per millilitro per 24 ore e raccogliere il supernatante di coltura. Utilizzando un kit ELISA, misurare l'immunoglobulina G e l'immunoglobulina A.First, lanciare lo strumento web di bioinformatica ad accesso aperto GenomicScape.
Nel menu sfoglia dati selezionare il set di dati denominato cellule B umane in celle plasmatiche. La visualizzazione del profilo di espressione genica di un gene univoco o di un elenco di geni è disponibile utilizzando lo strumento Expression/Coexpression Report negli strumenti di analisi. Selezionare Quindi Strumenti di analisi webSAM per caricare lo strumento SAM.
Scegliere le cellule B umane nel set di dati delle celle plasmatiche e selezionare il gruppo di campioni da confrontare. Utilizzare i diversi filtri disponibili per applicare le opzioni di filtro di interesse. Per confrontare i profili di espressione genica con lo strumento SAM, modificare le opzioni di filtro, tra cui la modifica della piegatura, il numero di permutazioni, la velocità di individuazione falsa e il tipo di confronto.
Il software calcola l'analisi e fornisce geni espressi in modo differenziato tra i gruppi selezionati. In questo studio, vengono studiati i cambiamenti di espressione dei fattori epigenetici nella normale differenziazione delle cellule plasmatiche. Utilizzando l'analisi SAM multiclasse, Si vede che 71 geni sono significativamente espressi in modo differenziato tra le cellule B della memoria, i preplasmablasti, i plasmablasti, le prime cellule plasmatiche e le cellule plasmatiche del midollo osseo con un tasso di scoperta falso inferiore al 5%Lo stadio cellulare della memoria B è caratterizzato dalla sovraespressione di 23 geni del giocatore epigenetico, tra cui il 39,13% dell'acetiltransferasi istonale, il 30,43% delle transferasi istonali , il 21,74% delle demetilasi istone, il 4,35% delle proteine leganti metiliche e il 4,35% delle deacetilasi istono.
14 geni del giocatore epigenetico sono sovraespressi in modo significativo allo stadio del preplasmablasto, tra cui il 50% dell'istone metiltransferasi, il 14,28% del DNA metiltransferasi, il 21,43% delle deacetilasi istone, il 7,14% delle demetilasi istone e il 17,14% delle acetiltransferasi istone. Seguendo questa procedura, potrebbero essere eseguite diverse analisi per identificare e comprendere le modifiche nella struttura e nell'architettura della cromatina durante questa differenziazione delle cellule plasmatiche B2. Questo modello di differenziazione in vitro permetterà di generare abbastanza cellule per completare questa analisi molecolare per rivelare sia le vie coinvolte in tutta questa modellazione che il loro impatto trascrizionale a valle durante la differenziazione delle cellule plasmatiche B2.
Queste conoscenze derivate da questa ricerca potrebbero informare e istruire sulle strategie diagnostiche e terapeutiche per i disturbi delle cellule plasmatiche, come nel caso del mieloma multiplo, un cancro senza una cura definitiva, per il quale sono fondamentali una migliore prognosi e strategie terapeutiche migliorate. Caratterizzare e comprendere i cambiamenti strutturali e architettonici di rimodellamento epigenetico che influenzano la cromatina durante la differenziazione delle cellule plasmatiche B2 sarà di particolare interesse. Questo potrebbe essere fatto usando sequenziamento genico, ERRBS, sequenziamento ATAC, IC e sequenziamento dell'RNA.
Un'eterogeneità moderata potrebbe essere osservata nella percentuale di cellule B attivate, preplasmablasti, plasmablasti e cellule plasmatiche, a seconda del sangue del donatore sano, utilizzato per la purificazione cellulare della memoria B.
