Ringraziamo il Dott. Clemens Wendtner per fornire tmuCD40-Ligand-HeLa linea cellulare.

Il protocollo per la generazione di murino CD40 delle cellule B attivate (mCD40B) da splenociti è diviso in due parti: la parte A dimostra la preparazione di murino CD40 ligando (CD40L) che esprime cellule HeLa (tmuCD40L HeLa), che sarà usato come piastra legato cellule nutrici. Parte B descrive l&#39;attuale murino B CD40-cultura. A. Preparazione di cellule di alimentazione (tmuCD40L HeLa) Il HeLa tmuCD40L è un aderente linea di cellule epiteliali umane, che non dovrebbe mai diventare completamente confluenti. Le cellule sono quindi suddivisi due volte alla settimana. Coltura per più di 6 settimane non è raccomandato. <ol><li> Rimuovere medio vecchio dalla coltura primaria con una pipetta sterile e lavare le cellule con 10 ml di PBS 1x. Aspirare il PBS dopo il lavaggio. </li><li> Aggiungere 4 ml di 1x tripsina / EDTA in 75 2 centimetri a riposo per 10-15 minuti a 37 ° C. Usa picchiettando leggermente per staccare le cellule. </li><li> Aggiungere 10 ml di medium di tipo selvatico e girevole delicatamente per fermare la digestione con tripsina. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml con una pipetta sterile e girare le celle in basso a 265 xg per 7 minuti. </li><li> Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di medium di tipo selvatico. Contare il numero di cellulare di una aliquota della sospensione cellulare e preparare tre da 50 mL con il numero appropriato di cellule: <ol><li> 2,5 x 10 6 cellule per la subcultura </li><li> 0,4 x 10 6 cellule / pozzetto di irradiazione utilizzate nel murino CD40-B colture cellulari </li><li> resto di congelare (se necessario). </li></ol></li><li> Spin le cellule verso il basso a 265 xg per 7 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante. <ol><li> Per subcolture: risospendere 2,5 x 10 6 cellule in 10 ml di medie selezione in un centimetro 75 2 pallone di coltura cellulare (cellule densità di 2,5 x 10 5 cellule / ml) e incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. Dividere le celle due volte alla settimana. </li><li> Per la murino CD40-B coltura cellulare: Avete bisogno di 2,4 x 10 6 cellule per un 6-pozzetti. Risospendere le cellule tmuCD40L HeLa wild-type in media ad una densità di 0,2 x 10 6 cellule / ml e irradiare li a 78 Gy. Tavola 2 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto e incubare loro a 37 ° C con 5% di CO 2. Utilizzare questa piastre preparate per la stimolazione delle cellule B quando tmuCD40L cellule HeLa sono aderenti (almeno 4 ore: controllare l&#39;aderenza con il microscopio, non aspettare più di 24 ore per iniziare la stimolazione delle cellule B). (Continua con B.) </li></ol></li></ol> B. murini CD40-B colture cellulari I. Preparazione di splenociti per CD40-stimolazione (giorno 0): Attenzione: prima di continuare a constatare che le cellule feeder siano aderenti. Aggiungere sempre soluzioni fresche di murini immediatamente interleuchina-4, β-mercaptoetanolo e ciclosporina A per il mezzo di crescita prima dell&#39;uso. <ol><li> Sezionare milza di C57BL / 6 topi (aplotipo H-2b) e lavarlo due volte in 10-20 ml DMEM integrato con Gentamicina [15μg/mL] trasferendo con una punta da 10 ml pipetta da un tubo ad un altro. Evitare il trasferimento di contaminanti (ad esempio capelli) del mouse. Tritare milza passando attraverso un colino cella (100μm) e risciacquare con un altro filtro ml 10 di media. Spin down splenociti a 265 xg per 7 minuti a temperatura ambiente, li risospendere in 7 ml muCD40 media delle cellule-B e linfociti separati per centrifugazione densità Ficoll. Per fare questo strato di cellule, il 5 ml Mouse-Pancoll (preriscaldato a temperatura ambiente) in una provetta da 15 ml e centrifugare a 450 xg per 30 min, senza freno a temperatura ambiente. </li><li> Erogare la maggior parte dello strato superiore, lasciando il livello dei linfociti indisturbato a livello di interfaccia. Trasferimento strato linfociti ad un nuovo tubo da 50 ml, lavare una volta con DMEM 30mL con Gentamicina [15μg/mL] riducendo la velocità a 265 xg per 7 minuti per eliminare altre cellule. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 10 ml di mCD40-B medio di lavaggio. Determinare il numero di cellule in una parte aliquota della sospensione cellulare. Determinare il numero delle cellule contando una aliquota della sospensione cellulare. </li><li> Spin down la quantità necessaria di cellule a 265 xg per 7 minuti. Per un 6-pozzetti 5 x 10 6 cellule / pozzetto sono necessari, quindi 30 x 10 6 cellule per piastra. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere i linfociti a 1,25 x 10 6 cellule / ml in mCD40-B terreno di coltura fresco integrato con 1 U / mL di interleuchina-4 come fattore di crescita, 100 mM β-mercaptoetanolo e 0,63 mg / ml ciclosporina A per prevenire conseguenza di cellule T (concentrazioni indicati si riferiscono a un mezzo ml cultura!). </li><li> Eliminare il surnatante dal 6 pozzetti pre-incubate con tmuCD40L cellule HeLa. </li><li> Delicatamente aggiungere 4 ml di sospensione linfocitaria (1,25 x 10 6 cellule / ml) in ciascun pozzetto della piastra ben 6. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO 2. </li&gt; <li> Il giorno 3 reculture le cellule (Continua con II.1.). </li></ol> II. Sottocultura di cellule mCD40B (giorno 3 e poi due volte a settimana): <ol><li> Grappolo di cellule raccolta mCD40B da vigorosamente pipettando su e giù con una pipetta da 10 mL e la piscina in un tubo da 50 ml. </li><li> Spin down a 265 xg per 7 minuti e sostituire completamente il sopranatante con mCD40-B medio di lavaggio. Mentre conta la quantità delle cellule di una aliquota, girare la celle in basso a 265 xg per 7 minuti. Risospendere le cellule in mCD40B mCD40-B terreno di coltura ad una concentrazione di 0,75 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aggiungi soluzioni fresche di murini interleuchina-4 in una concentrazione di 1 U / mL, 100 mM β-mercaptoetanolo e 0,63 mg / ml ciclosporina A per la media. </li><li> Rimuovere il surnatante da un 6-pozzetti pre-incubate con irradiati tmuCD40L cellule HeLa. </li><li> Delicatamente aggiungere 4 ml di sospensione cellulare mCD40B (0,75 x 10 6 cellule / ml) in ciascun pozzetto della piastra ben 6. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Anche in questo caso le cellule sottocultura ogni 3-4 giorni per finire con elevata purezza murino CD40 delle cellule B attivate dopo un totale di 14 giorni. </li></ol> C. Soluzione dei problemi: cosa succede se le cellule B CD40-non crescono? <ol><li> Hai controllato di espressione ligando CD40 delle cellule alimentatore? </li><li> Sono legato piastra cellule alimentatore utilizzato per la stimolazione più di 24 ore? </li><li> C&#39;è una contaminazione con micoplasma? </li><li> È stata la interleuchina-4 soluzione utilizzata per la supplementazione appena scongelati e ce l&#39;ha l&#39;attività biologica appropriata? </li><li> Era β-mercaptoetanolo e ciclosporina A aggiunti nella concentrazione giusta? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="Figura 1 a" /> Figura 1a. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="Figura 1 b" /> Figura 1b. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="Figura 1 d" /> Figura 1d. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2.

<ol>
	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali ed europee per il mantenimento degli animali da laboratorio. Riferendosi alla legge tedesca sul benessere degli animali gli animali erano controllati regolarmente dalle autorità competenti.

Le modifiche di questo protocollo sono possibili, soprattutto per quanto riguarda l&#39;origine di CD40-stimolo e il tipo di ceppo di topi utilizzati, anche cedendo nella generazione efficiente di murini CD40 delle cellule B attivate. Ahmadi et al. hanno mostrato risultati simili per i fibroblasti di topo murine transfettate con CD40-ligando. In questa presentazione contesto di xeno-antigene può essere esclusa con certezza, ma studi approfonditi in materia di sicurezza e tossicità in vivo non ha dato segni di...

A. Preparazione dei supporti: <table border="1"><tbody><tr><td> Alimentatore cellule wild type media </td><td> Alimentatore cellulare medio selezione </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> 300 mg / ml </td><td> L-Glutammina </td><td> 300 mg / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycin B </td><td> 0,2 mg / ml </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B lavaggio medio </td><td> mCD40-B terreno di coltura </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> 580 mg / ml </td><td> L-Glutammina </td><td> 580 mg / ml </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 4,5 mg / ml </td><td> Glucosio </td><td> 4,5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0.1mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Varie Reagenti: <table border="1"><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Il decreto n. </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Nessun gatto H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Delta Select </td><td> Art. n. 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Nessun gatto DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES Buffer </td><td> PAA </td><td> Nessun gatto S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> PAA </td><td> Nessun gatto P02-015 </td></tr><tr><td> Ricombinante murino interleuchina-4 </td><td> Immunotools </td><td> Nessun gatto 12340045 </td></tr><tr><td> Ciclosporina A </td><td> Novartis </td><td> Nessun gatto NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. Varie Forniture: <table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Il decreto n. </td></tr><tr><td> Puntali sterili </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 pozzetti </td><td> NUNC </td><td> Nessun gatto 140675 </td></tr><tr><td> 50mL tubo conico </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Nessun gatto 352070 </td></tr><tr><td> Tessuto cultura fiasco </td><td> Sarstedt </td><td> Nessun gatto 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

La ricerca sulle cellule B CD40 ha dimostrato che l&#39;attivazione di migliorare la loro capacità di presentazione dell&#39;antigene. Se stimolati con interleuchina-4 e CD40 ligando (CD40L), le cellule B umane può essere ampliato senza difficoltà da piccole quantità di sangue periferico entro 14 giorni di tempo per grandi quantità di altamente puri-CD40 delle cellule B (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Cellule per paziente) da donatori sani e pazienti affetti da cancro<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Cellule CD40-B esprimere importanti molecole nodo homing linfa e in grado di attrarre le cellule T<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Inoltre, essi occupano in modo efficiente, elaborare e presentare antigeni alle cellule T<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Cellule CD40-B hanno dimostrato di non solo ingenuo primo, ma anche di espandere le cellule T di memoria<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Pertanto CD40-attivate le cellule B (linfociti B CD40-) sono stati studiati come fonte alternativa di immuno-stimolatorie cellule presentanti l&#39;antigene (APC) per i cellulari basati su immunotherapy1, 5,10. Per studiare ulteriormente se le cellule CD40-B inducono efficace le risposte delle cellule T in vivo e studiare il meccanismo di base abbiamo stabilito un sistema di coltura cellulare per la generazione di murino CD40 delle cellule B attivate. Utilizzando splenociti depurati o linfociti B di topi C57BL / 6 per CD40-attivazione, le condizioni ottimali sono stati identificati come segue: A partire da splenociti di C57BL / 6 topi (aplotipo H-2b) linfociti sono purificati mediante centrifugazione a gradiente di densità e di co-coltura con HeLa cellule che esprimono ricombinante murino ligando CD40 (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Le cellule sono recultured ogni 3-4 giorni e componenti chiave, quali CD40L, interleuchina-4,-mercaptoetanolo e ciclosporina A sono reintegrati. In questo protocollo dimostriamo come ottenere pienamente attivato murino CD40 delle cellule B (mCD40B) con simili APC-fenotipo di umani CD40 delle cellule B (Fig. 1a, b). CD40-stimolazione porta ad una conseguenza rapida espansione e di elevata purezza (&gt; 90%) delle cellule CD19 + B entro 14 giorni di coltura cellulare (Fig. 1c, d). Per evitare la contaminazione con le cellule non transfettate, espressione del ligando CD40 murino sulla trasfettate deve essere controllata regolarmente (Fig. 2). Murino CD40-attivate le cellule B possono essere utilizzati per studiare l&#39;attivazione delle cellule B e la differenziazione così come per indagare il loro potenziale di funzionare come APC in vitro e in vivo. Inoltre, essi rappresentano uno strumento promettente per stabilire la vaccinazione terapeutica o preventiva contro i tumori e contribuirà a rispondere a domande riguardanti la sicurezza e l&#39;immunogenicità di questo approccio<sup&gt; 12</sup&gt;.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

In questo video, dimostriamo la procedura di CD40-attivazione e l&#39;espansione delle cellule B da splenociti murini di C57BL / 6 topi, che può essere utilizzato come modello di una cellula presentanti l&#39;antigene (APC) per studiare l&#39;induzione di immunità.

Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.5K Views.  University Hospital of Cologne. In questo video, dimostriamo la procedura di CD40-attivazione e l'espansione delle cellule B da splenociti murini di C57BL / 6 topi, che può essere utilizzato come modello di una cellula presentanti l'antigene (APC) per studiare l'induzione di immunità.