Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle perturbazioni nelle reti di segnalazione che possono causare la crescita del cancro o lo sviluppo di resistenza a terapie specifiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può fornire un feedback rapido e affidabile sullo stato di fosforilazione di più reti che sono spesso deregolamentate nel cancro. L'implicazione di questa tecnica si estende verso la terapia dei tumori resistenti ai farmaci perché l'identificazione di alterazioni e modifiche post-tras tras trasmissizionali può chiarire i cambiamenti nell'attività della via di trasduzione del segnale.
Mentre questa tecnica è usata sulla fosforilazione, può anche essere usata per esaminare altre modifiche post-traslazionali come la glicosilazione e l'ubiquità. Iniziare risciacquando accuratamente le cellule coltivate durante la notte tre volte con 10 millilitri di PBS, facendo attenzione a rimuovere tutto il PBS dopo l'ultimo lavaggio. Quindi, aggiungere il volume appropriato di tampone di lisi dal kit di dosaggio proteico e utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule.
Triturare la soluzione cellulare risultante circa 10 volte prima di trasferire almeno una volta 10 alla settima cella in un tubo da 1,5 millilitri. Incubare le cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius con tremori. Quindi caricare il lisato in una siringa dotata di un ago calibro 27 e aspirare e erogare il campione 10 volte per tagliare le membrane cellulari.
Quando le membrane cellulari sono state completamente interrotte, centrifugare il litolato e trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri per la successiva quantificazione totale delle proteine secondo protocolli standard. Per eseguire un saggio umano sulla fosfochinasi, utilizzare prima una pinzetta a punta piatta per posizionare una membrana array in ogni pozzo di un multi-vassoio a quattro poggiapiedi contenente due millilitri di tampone array appena preparato uno per bene con i numeri delle membrane rivolte verso l'alto. Al momento dell'immersione, il colorante sulla membrana scomparirà.
Coprire il vassoio con un coperchio e incubare le membrane su uno shaker a piattaforma a dondolo per 60 minuti a temperatura ambiente. Durante questa incubazione di blocco, diluire ogni campione di lisato a 50-100 microgrammi di concentrazione proteica in un volume massimo di 334 microlitri di tampone di lisi e portare il volume finale del campione proteico estratto fino a 1,5 millilitri con tampone di matrice fresco. Successivamente, aspirare attentamente il buffer array da ogni pozzo del multi-vassoio e incubare le membrane con 1,5 millilitri di campione proteico per pozzo durante la notte a due o otto gradi Celsius su uno shaker a piattaforma a dondolo.
La mattina seguente, trasferire accuratamente ogni array in singoli contenitori di plastica contenenti 20 millilitri di tampone di lavaggio per tre lavaggi di 10 minuti su una piattaforma a dondolo a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 20 microlitri dell'appropriato cocktail anticorpale ricostituito a due millilitri di tampone di matrice, due per pozzo, e tamponare con cura il bordo inferiore di ogni membrana su un tovagliolo di carta per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio in eccesso. Quindi riposizionare ogni array nel pozzo appropriato del vassoio dell'anticorpo e coprire il vassoio per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo.
Alla fine dell'incubazione, trasferire accuratamente ogni array in un nuovo contenitore di plastica da otto per 11 centimetri contenente 20 millilitri di tampone di lavaggio per tre lavaggi di 10 minuti come appena dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di un'appropriata soluzione di perossidasi di ravanello di cavallo streptavidina ad ogni pozzo del vassoio multi-pozzo e riportare le membrane nei loro pozzi appropriati per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, posizionare ogni membrana tra due pezzi di carta da filtro di cinque millimetri per rimuovere qualsiasi tampone in eccesso e incubare le membrane essiccate con un'appropriata soluzione di rilevamento della perossidasi del ravanello del cavallo per tre minuti.
Quindi posizionare le membrane in singole protezioni per fogli di plastica trasparente per la successiva imaging. Per valutare l'espressione della tirosina chinasi recettore in ogni campione, aprite le immagini in un programma di elaborazione delle immagini appropriato come Image J e selezionate Modifica e inverti dai menu a discesa appropriati per invertire le macchie nere sullo sfondo bianco dell'immagine in macchie bianche su uno sfondo nero. Utilizzare quindi lo strumento Ovale per circondare una coppia di punti bianchi sulla macchia di punti e selezionare Analizza e misura per aprire automaticamente una nuova finestra che visualizza i valori per l'area selezionata.
Quindi posizionare il punto della freccia del mouse al centro dell'ovale e trascinare l'area circolare intorno all'area del punto successivo fino a quando non sono stati misurati tutti i punti di interesse. In questo esperimento rappresentativo, gli effetti della resistenza inibitore della tirosina chinasi sulle vie di trasduzione del segnale sono stati analizzati in un controllo su tre linee cellulari resistenti all'inibitore della tirosina chinasi. Sono state scelte sei proteine fosfo con attività differenziale e l'intensità relativa è stata determinata per diverse proteine candidate in ogni linea cellulare.
Come dimostrato dalla mappa termica, potrebbe quindi essere generata una lettura semi-quantitativa sui cambiamenti nella fosforilazione proteica di importanti proteine di trasduzione del segnale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di iniziare con cellule sane e che dividono attivamente poiché gli stressanti possono indurre cambiamenti nell'attività del percorso di trasduzione del segnale. Seguendo questa procedura, altri metodi come la PCR digitale e l'immunoblotting possono essere utilizzati per rispondere a domande aggiuntive come i cambiamenti nella fosforilazione portano all'attivazione di fattori di trascrizione?
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori in biologia del cancro per esplorare i cambiamenti fondamentali nella modifica post-traslazione delle proteine che portano all'avvento della medicina personalizzata per i pazienti con cancro. Non dimenticare che lavorare con le linee cellulari tumorali è estremamente pericoloso, quindi assicurati di usare tecniche asettiche, cautela quando smaltisci i taglienti e indossa sempre un camice da laboratorio.
