La capacità di acquisire grandi quantità di dati da esperimenti di imaging del calcio è drasticamente migliorata, specialmente con gli esperimenti di imaging tissutale. I nostri protocolli descrivono tecniche di analisi appropriate per quantificare e descrivere questi set di dati. I nostri protocolli generano una gamma di valori spaziali, temporali e di intensità che sono intrinseci alla segnalazione del calcio in interi tessuti e questo può essere perso in analisi più rudimentali.
Un'ora prima del trasferimento dell'imaging un intestino tenue raccolto da un topo con cellule interstiziali di Cajal o ICC che esprimono specificamente un indicatore di calcio geneticamente codificato allo stadio di un microscopio confocale del disco rotante. E perfonde continuamente il tessuto con bicarbonato Di 37 gradi Celsius Krebs-Ringer o soluzione KRB. Utilizzando un ingrandimento da 60 a 100 X individuare il plesso myenterico a forma stellata ICC o ICC-MY tra gli strati muscolari lisci circolari e longitudinali dell'intestino tenue.
Quindi individuare il plesso muscolare profondo a forma di mandrino ICC o ICC-DMP in un unico piano tra lo strato muscolare liscio circolare e il plesso submucoso e salvare i film come una pila di immagini TIFF. Per creare mappe spaziotemporali o MTM dell'attività calcio ICC-DMP, aprire lo stack di immagini in ImageJ e fare clic su Immagine, Tipo e a 32 bit per modificare la qualità dell'immagine. Per creare un'analisi delle linee, fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento di selezione della linea e selezionare la linea segmentata.
Utilizzando i singoli clic a sinistra disegnare una linea lungo l'accesso centrale di un singolo ICC-DMP, facendo doppio clic quando l'intera cella è stata delineata. Selezionate Immagine (Image), Pile (Stacks) e Rislice (Reslice). Verrà visualizzata una finestra popup.
Selezionare Ruota di 90 gradi per orientare la scansione della linea da sinistra a destra in modo che possa essere calibrata e letta rispetto al tempo sull'asse x con spazio sull'asse y e fare clic su OK. Apparirà la mappa spatiotemporale. Per misurare con precisione l'ampiezza dei segnali di calcio dalla mappa, selezionare la selezione rettangolare e disegnare una regione di interesse intorno all'area all'interno dell'STM che mostra l'area di fluorescenza più uniforme e meno intensa. Fate clic su Analizza (Analyze) e Istogramma (Istogram) per ottenere un valore medio dell'intensità all'interno dell'area di interesse selezionata e fate clic su Modifica (Edit), Selezione (Selection), Seleziona tutto (Select All) per selezionare l'intero STM.
Quindi, fate clic su Processo (Process), Matematica (Math) e Dividi (Divide) e immettete il valore medio dell'intensità con l'area STM selezionata di interesse nella casella popup. L'STM diventerà nero. Correggere questa impostazione facendo clic su Immagine, Regola, Luminosità/Contrasto e Automatico nella finestra popup.
La scansione di linea sarà ora calibrata per l'ampiezza con l'intensità della fluorescenza espressa come fluorescenza divisa per la fluorescenza zero. L'STM mostrerà il numero di fotogrammi nello stack TIFF sull'asse x e il numero di pixel che rappresentano la lunghezza della cella sull'asse y. Per quantificare i dati temporali e spaziali dai segnali calcio, fare clic su Immagine e proprietà e immettere i valori appropriati per calibrare completamente l'STM per spazio e tempo nella finestra popup.
Per analizzare i singoli eventi calcio, fate clic su Linea retta (Straight Line) e fate clic e trascinate l'STM per disegnare una linea orizzontale retta attraverso il centro di un evento calcio parallelo all'asse x. Quindi fate clic su Analizza (Analyze) e traccia profilo (Plot Profile). Apparirà una scatola che mostra il profilo della trama dell'evento calcio.
Per l'analisi basata su particelle dei dati di segnalazione del calcio ICC-MY, aprite il file filmato in Volumetry e fate clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Filtro STK (STK Filter), Differenzia (Differentiate). Fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse per immettere un valore da differenziare. Premere INVIO e fare clic con il pulsante sinistro del mouse per avviare la differenziazione.
Per creare particelle, usate il pulsante centrale del mouse per scorrere il filmato per selezionare una sezione di fotogrammi da 20 a 40 che include un periodo quiescente, seguita dall'occorrenza di un cluster transitorio di calcio e da 20 a 40 fotogrammi che seguono subito dopo il cluster. Quando tutti i fotogrammi sono stati selezionati, fate clic con il pulsante destro del mouse nella finestra del filmato per accedere alle informazioni sulle particelle STK OPS Ramp DS e fate clic per eseguire una routine di analisi delle particelle che aumenta progressivamente la soglia dall'intensità massima a quella minima. Per garantire un'analisi delle particelle di successo, assicurarsi di incorporare quanta più non attività dell'ammasso transitorio pre-calcio e quanta più non attività dell'ammasso transitorio post-calcio possibile.
Ciò contribuirà ad aumentare il rapporto segnale/rumore. L'analisi verrà visualizzata graficamente nella finestra del grafico come grafico del rumore e nella finestra delle tracce come tre tracce di colore con la traccia verde che rappresenta il numero di particelle, la traccia rossa che rappresenta la dimensione media delle particelle e la traccia blu che rappresenta la soglia di intensità assoluta. Per l'istogramma bilanciare la trama della pressione del rumore delle particelle H sulla tastiera.
Quindi premere il tasto della parentesi destra per scorrere le combinazioni di colori fino a quando lo sfondo non è bianco con le tracce di colore in alto. Premere F sulla tastiera una volta per creare uno strumento di misurazione. Quindi premere F una seconda volta per contrassegnare una singola linea verticale nella barra di scorrimento della finestra delle tracce sul tracciato all'intersezione in cui i grafici colorati iniziano a spostarsi sul lato destro.
All'interno della finestra delle tracce utilizzare il pulsante centrale del mouse per scorrere dal punto di flessione della traccia rossa alla linea verticale bianca contrassegnata. Dopo aver annotato la media Y visualizzata, fare di nuovo clic sul pulsante centrale del mouse all'interno della finestra delle tracce per deselezionare la traccia blu. Nella finestra del filmato fare clic su C per far salire una ruota dei colori e su D per regolare la soglia.
Le particelle valide saranno ora mostrate in rosso e quelle sature saranno bianche. Utilizzare il pulsante sinistro del mouse per scorrere fino a rimuovere le aree bianche e utilizzare il pulsante centrale del mouse per regolare il valore numerico giallo nella rotellina di colore sul valore medio Y per assegnare tutto in rosso come particella transitoria di calcio attivo nel punto di soglia determinato. Per salvare i dati come file di particelle basato su coordinate, fate clic con il pulsante destro del mouse per accedere a STK 3D, salvate la particella zero e fate clic con il pulsante sinistro del mouse per salvare il file.
Per creare mappe di calore dell'attività delle particelle, aprite il file di particelle salvato e fate clic con il pulsante destro del mouse nella finestra del filmato per accedere alle particelle STKops, StatMap Flag e immettere le assegnazioni dei flag da analizzare. Fare clic per applicare l'analisi e una mappa termica che mostri le particelle totali per l'intera lunghezza della registrazione con colori diversi che rappresentano l'occorrenza percentuale durante la registrazione. Fare clic con il pulsante destro del mouse per salvare la mappa termica come file TIFF.
Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra del filmato per accedere alla misura delle particelle, le statistiche delle particelle STK sono uguali e immettere un'assegnazione di contrassegno per l'analisi. Una serie di tracce verrà generata nella finestra di traccia. L'analisi STM fornisce la capacità di monitorare e registrare le caratteristiche spaziali della segnalazione del calcio, come la diffusione spaziale e la velocità di propagazione.
Queste informazioni possono essere ammassate per fornire una visione piuttosto completa dei comportamenti di segnalazione del calcio all'interno delle cellule nei loro ambienti nativi. Utilizzando l'analisi delle particelle, le informazioni quantitative sulla segnalazione del calcio possono essere calcolate misurando l'area delle particelle e il conteggio delle particelle, che insieme possono essere utilizzate per determinare gli intervalli spaziali di attivazione del segnale di calcio all'interno di un campo visivo specificato. L'analisi delle particelle consente anche la quantificazione approfondita della segnalazione subcellulare del calcio attraverso l'esame della posizione e delle probabilità di attivazione dei siti di cottura del calcio.
Allocando le particelle in diverse bandiere in base alle loro caratteristiche temporali, le particelle di avvio possono essere mappate con precisione. E una ricchezza di dati dati rigidi acquisiti sul numero di siti di iniziazione, le dimensioni del sito in pixel e micrometri, la probabilità che ogni sito di iniziazione ucciva una o più volte durante ogni ammasso transitorio di calcio e la percentuale di siti di cottura che si sparano durante ogni ciclo del cluster transitorio di calcio. La coerenza è la chiave del successo di questo protocollo.
Tutti i set di dati e tutti i filmati devono essere trattati esattamente allo stesso modo per garantire risultati affidabili e ripetibili. Questo è particolarmente vero quando si ha a che fare con file di particelle. I nostri protocolli consentono una caratterizzazione profonda della segnalazione del calcio in situ e una serie di metodi statistici, se usati in modo appropriato, possono valutare le differenze tra una gamma di parametri spaziali e temporali.
Queste tecniche di analisi nel nostro protocollo hanno permesso ai ricercatori di porre e rispondere a domande precedentemente non indirizzabili relative al pacemaking intestinale e all'innervazione intestinale, nonché al controllo neuronale del tratto urinario inferiore.
