Questo protocollo è il nostro metodo a base cellulare per la terminazione del colesterolo del reflusso di colesterolo nel plasma ceramico. Soprattutto nelle proiezioni. Questo può essere applicato per diagnosticare il rischio cardiovascolare e per identificare o valutare il mantenimento del colesterolo più basso.
Questa tecnica evita il rischio e gli oneri in quanto la sicurezza con la manipolazione di materiali irradiati fornendo risultati con livelli di qualità comparabili, a quelli del reflusso di colesterolo è stato segnalato per associarsi a Così, il reflusso plasmatico o colesterolo ceramico di accettato può essere confrontato, al nostro controllo di riferimento e può fornire il rischio di soffrire di Questo metodo sarà applicato anche alle linee cellulari , come altre linee cellulari umane o anche fasi macro primarie. Macro fasi o e cellule staminali a pulsante spray indotte dall'uomo. Per iniziare questa procedura, sciogliere il colesterolo NPD in etanolo puro per ottenere una soluzione stock con una concentrazione finale di due micromolari.
Diluire 25 microlitri dello stock di colesterolo NBD nel mezzo AR 10 per raggiungere una concentrazione finale di cinque micromolari. Coltura thp-1 cellule nel nostro mezzo 10 a 37 gradi celsius con 5% di anidride carbonica. Ogni tre giorni regolare la densità cellulare a 300000 cellule per millilitro.
Quindi ottenere una piastra da 96 po 'con un fondo piatto e chiaro. Per una migliore omogeneizzazione, preparare 10 millilitri di cellule thp-1 in un tubo da 15 millilitri e aggiungere 200 microlitri di materiale PMA. Mescolare delicatamente e seminare 100 microlitri della miscela nei pozzi piastra a 200.000 cellule per pozzo.
E incubare a 37 gradi celsius con 5% di anidride carbonica per 48-72 ore per differenziare le cellule thp-1 in cellule DM thp-1. Prima diluire la glicina nel 10%PBS con acqua sterile, ad una concentrazione di 200 micromolari a pH 7,4. Aggiungere 40 millilitri di glicina diluita a 10 grammi di piolo 8000 per preparare una soluzione di peg del 20% e mescolare vigorosamente per omogeneizzare.
Successivamente applicare quattro parti del 20% per 10 parti del campione su ciascun siero o campione di plasma in un tubo da 1,5 ml. Lasciare la miscela sul ghiaccio per 25 minuti. Centrifugare il piolo apolipoproteina B precipitato a 13000 volte G, e a quattro gradi celsius per 15 minuti.
Scartare il precipitato e trasferire il supernatante su un nuovo tubo. Recuperate la piastra contenente le celle thp-1 differenziate. Rimuovere e scartare il supporto di coltura, quindi lavare le celle due volte con 1X PBS.
Aggiungere 100 microlitri di colesterolo MVD micromolare in ar-10 medio ad ogni pozzo. Incubare durante la notte a 37 gradi celsius con 5% di anidride carbonica. Il giorno dopo scartare, scartare il mezzo.
Lavare le cellule due volte con PBS, quindi aggiungere 100 microlitri ABDS, o accettore lipidico purificato diluito in rpmi 1630 medio alla concentrazione desiderata ad ogni pozzo. Includere un controllo negativo che non contenga accettori di colesterolo in un controllo positivo, come delineato nel protocollo di testo, e incubare a 37 gradi celsius per quattro o sei ore. Nel frattempo, preparare uno stock di 200 millilitri di soluzione di lysis cellulare uno come delineato nel testo.
Mescolare questa soluzione con l'etanolo, ad un rapporto volumetrico uno a uno per ottenere anche la soluzione di lisi. Per il rilevamento del colesterolo media e BD, rimuovere il mezzo cellulare dalle piastre raccolte in una nuova piastra bianca da 96 po 'con un fondo piatto opaco. Aggiungere 100 microlitri di etanolo puro a 100 microlitri di ogni campione medio per ottenere un rapporto uno a uno nella nuova piastra.
Usando un illuminometro, misurare l'intensità del fluorescente ad un'eccitazione di 463 nanometri e un'emissione di 536 nanometri. Per il rilevamento del colesterolo NBD intracellulare, lavare le cellule due volte con PBS. Aggiungere anche 100 microlitri di soluzione di lisi ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente, tremando per 25 minuti.
Successivamente, misurare l'intensità del fluorescente regolando il parametro di sensibilità a 50 nel software. Quindi determinare il tasso di efflusso del colesterolo nella misura finale dell'efflusso di colesterolo come delineato nel protocollo di testo. Diluire il colesterolo NBD in etanolo puro produce i più alti valori di intensità fluorescente mentre un alto contenuto in soluzione acquosa, abbassa l'intensità.
Ciò suggerisce che l'emissione fluorescente di questa molecola è altamente dipendente dal mezzo, in cui è contenuta. Quando si utilizza una miscela di media ed etanolo ad un rapporto uno a uno, l'intensità del fluorescente sembra aumentare proporzionalmente, con una concentrazione dell'analogo del colesterolo, suggerendo che la sonda si sta comportando in modo appropriato in queste condizioni. Per determinare la quantità di tempo necessaria per incubare le cellule caricate con accettori di colesterolo, il supporto cellulare viene raccolto in diversi punti di tempo.
L'efflusso del colesterolo si è evoluto linearmente da zero a sei ore, con il segnale massimo catturato sei ore dopo l'aggiunta di ABDS alle cellule. La soglia di saturazione e l'intervallo dinamico vengono testati misurando l'efflusso di colesterolo a diverse percentuali di supporti contenenti HDL. Nell'asset ad alta produttività, l'efflux si evolve linearmente da uno al 7%ABDS, raggiungendo il picco della capacità di efflusso del colesterolo al 7%A concentrazioni superiori al 7% l'intensità del fluroescente diminuisce in una relazione inversa con la percentuale ABDS.
Le prestazioni del metodo basato sulla fluorescenza vengono quindi valutate confrontandolo con la tecnica standard con etichetta radio. Entrambe le tecniche sono altamente correlate quando si utilizzano diverse concentrazioni di ABDS. Il metodo descritto è sensibile ad un aumento delle concentrazioni di accettori all'interno dei valori di efflusso del colesterolo tra il cinque e il 15%È importante assicurarsi che il celluarizer non contenga aggregati.
Il punto critico è quello di classificare un etanolo aggregato contenente ambiente, per misurare la fluorescenza in un peso omogeneo e ottimale. Seguendo questa procedura, è possibile misurare il colesterolo tecnico del nome e determinare l'effetto dei farmaci nella via dell'efflusso del colesterolo. Anche la scuola alla fine viene utilizzata come diagnostica per valutare il rischio cardiovascolare.
Riteniamo che questo metodo sia molto più facile e sicuro del metodo dello standard radioattivo. Tuttavia è ancora dipendente dalla cella. Si prega di ricordare che l'etanolo è infiammabile e deve essere conservato e maneggiato di conseguenza.
