Il nostro sistema di coltura cattura la plasticità fenotipica delle cellule carcinoma polmonari squamose in risposta alle interazioni tumore-stroma e come queste interazioni regolano la morfologia tumorale durante la progressione del carcinoma a cellule squamose polmonari. Il principale vantaggio del nostro sistema è la sua capacità di modellare la biologia cellulare squamosa polmonare in un contesto 3D preservando la plasticità delle cellule maligne. Questa cocultura 3D fornisce un sistema unico per indagare le interazioni tra cellule tumorali e stroma e potrebbe essere adattata per monitorare le risposte delle cellule carcinoma a cellule squamose polmonari e dei fibroblasti associati al cancro al trattamento farmacologico.
Per iniziare, scongelare flaconcini di matrice di membrana basale in un frigorifero di quattro gradi Celsius durante la notte. Raffreddare pipette di plastica da due millilitri e punte a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo, riscaldare i reagenti utilizzati per dissociare le cellule TUM622, il buffer HEPES, la tripside/EDTA e il tampone di neutralizzazione della tripina in un bagno d'acqua celsius di 37 gradi.
Togliere la matrice di membrana basale scongelata dal frigorifero e mettere il flaconcino sul ghiaccio. Raffreddare le piastre di coltura tissutale su un dispositivo di raffreddamento a piattaforma metallica posto sul ghiaccio. Posizionare tubi di centrifuga su un rack di raffreddamento metallico sul ghiaccio.
Calcolare la quantità di cellule necessarie in base al numero di pozzi e alla concentrazione di cellule in ogni pozzo da preparare. Trasferire la sospensione cellulare TUM622 in un tubo di centrifuga raffreddato e girare verso il basso a 300 volte g in una centrifuga a secchio sospesa a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Con una pipetta aspirante attaccata a una punta non filtrata, aspirare attentamente il supernatante, lasciando circa 200 microlitri del mezzo nel tubo.
Toccare delicatamente sul lato del tubo per rimuovere e dissociare il pellet e quindi restituirlo al rack di raffreddamento. Utilizzando le pipette preraffreddate a due millilitri, mescolare delicatamente la matrice sul ghiaccio pipettando su e giù alcune volte. Pipetta a una velocità uniforme e moderata in modo che non vengono introdotte bolle nella matrice durante questa procedura.
Trasferire 1,1 millilitri della matrice in ogni tubo di centrifuga. Utilizzando punte preraffreddate, pipettare la matrice in ogni tubo su e giù circa 10 volte per effettuare una sospensione cellulare uniforme. Trasferire 310 microlitri della sospensione della matrice cellulare in ogni pozzo di una piastra preraffreddata da 24 pozza.
Posizionare la pipetta con un angolo di 90 gradi sulla superficie della piastra e aggiungere la sospensione al centro del pozzo. La sospensione si diffonde e copre l'intero pozzo. Per facilitare l'analisi dell'immunofluorescenza a valle, trasferire 60 microlitri di sospensione a matrice cellulare nel centro del pozzo di uno scivolo a camera a due porri.
Ciò consente alla matrice di formare una struttura simile a una cupola con un volume molto più piccolo. Riportare la piastra e la camera scivolare di nuovo nell'incubatore di coltura tissutale e incubare per 30 minuti per consentire alla matrice di solidificarsi. Successivamente, esaminare la piastra e scorrere al microscopio luminoso per assicurarsi che le singole celle siano distribuite uniformemente all'interno della matrice.
Aggiungere un millilitro di coltura 3D pre-riscaldata mezzo completo in ogni pozzo della piastra e 1,5 millilitri di mezzo di coltura 3D in ogni pozzo dello scivolo della camera, quindi restituirli all'incubatore. Dopo aver preparato le sospensioni cellulari di TUM622 e CAF come descritto in precedenza, contare la densità cellulare CAF mescolando 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 microlitri di tripano blu. Aggiungere 10 microlitri della miscela a ciascuna delle due camere dell'emocitometro per contare e calcolare la densità cellulare.
Per co-incorporare cellule TUM622 e FF nella matrice della membrana basale, calcolare innanzitutto il numero desiderato di celle utilizzate per la placcatura in base alle informazioni sulla densità cellulare. I CEM vengono seminati con un rapporto 2:1 di cellule TUM622. Trasferire il volume calcolato di TUM622 e la sospensione cellulare CAF nello stesso tubo di centrifuga.
Spin down e aspirare tutto il mezzo. Resuspend nella matrice della membrana basale e piastra 310 microlitri della miscela in ogni pozzo di una piastra da 24 porri. Per l'immunofluorescenza, trasferire 60 microlitri di miscele TUM622 e CAF su vetrine da camera come descritto in precedenza.
Per coculare TUM622 con CAF sovrapposti nella matrice a membrana basale, impostare prima la monocoltura TUM622 come descritto in precedenza, trasferire il doppio del numero di sospensioni CAF in un tubo di centrifuga e girare verso il basso a 300 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e rimescolare le CAF nel mezzo di coltura, trasferire il doppio del numero di celle CAF che sono state rimescolate nel mezzo di coltura in ciascuno dei pozzi contenenti le celle TUM622 incorporate. Le tipiche cellule TUM622 in coltura 2D sono arrotondate con grandi nuclei mentre le FF sono piatte e allungate.
Sementi in coltura 3D, singole cellule TUM622 erano in grado di formare organoidi con morfologie acinarlike quando incorporate. Tra i cinque e i sette giorni, un lume divenne evidente nelle strutture dell'acinarlike e rimase vuoto in seguito. Ogni acinus, composto da un monostrato di cellule che circondavano il lume cavo, mostrava una corretta polarità basale apicale simile a quella dell'epitelio polmonare in vivo.
Queste strutture acinarlike erano iperplastiche e continuarono a crescere fino a 24 giorni prima che la matrice extracellulare si disintegrasse completamente. Nelle coculture TUM622-CAF, sovrapposte o co-incorporanti, la presenza di CAF ha notevolmente migliorato il numero e le dimensioni degli sferoidi formati. È interessante notare che, quando TUM622 acini entrò in stretta vicinanza con i TF, indusse gli acini a diventare invasivi e migrare verso i CEM, formando strutture simili a lacrima.
Per garantire una robusta formazione di strutture acinarlike, è fondamentale mantenere la matrice della membrana basale nella sua forma liquida durante l'intero processo di incorporamento delle cellule. Gli organoidi TUM622 possono essere utilizzati per una varietà di analisi a valle, tra cui immunofluorescente, immunoistochimica, citometria a flusso, RNA ed estrazione proteica e possono anche essere modificati per lo screening farmacologico. Utilizzando questo sistema come piattaforma, si può indagare come i cambiamenti intrinseci delle cellule tumorali e estrinsece cellulari nel microambiente tumorale possano influenzare l'architettura epiteliale tumorale e la formazione di carcinomi.
