Questo protocollo utilizza un metodo semplice per migliorare l'affidabilità di un modello di coltura cellulare 3D senza l'uso di apparecchiature speciali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo condurre l'esperimento di coltura 3D ripetibile controllando la condizione di coltura iniziale all'interno del dispositivo cubico. Dopo aver preparato un telaio cubico in policarbonato di cinque per cinque millimetri, posizionare il telaio su uno scivolo prerimorto e una ghiacciaia e utilizzare una pipetta per aggiungere 12 microlitri di agarosio preriscaldato dell'1,5% dalla faccia superiore del telaio cubico alla superficie inferiore.
Stendere l'agarosio per ottenere una superficie piana e consentire al polimero di polimerità. Utilizzare le pinzette per far scorrere il telaio sul bordo del vetro e ruotare il telaio in modo che il lato aperto sia rivolto verso il basso prima di riposizionare il telaio sullo scivolo. Dopo aver riempito le due superfici laterali del telaio con più agarosio, come appena dimostrato, far cadere l'agarosio in un contenitore da una faccia aperta per formare una parete di agarosio sul quarto e quinto lato.
Per impostare una forma cluster di celle iniziale, iniettare una matrice extracellulare appropriata per la coltura cellulare di interesse nello spazio di coltura del cubo gel ibrido e impostare un micro stampo fabbricato sul cubo. Quindi posizionare il cubo in un incubatore di anidride carbonica per 25 minuti a 37 gradi Celsius. Quando la matrice extracellulare viene polimerizzata, sollevare con cura il micro stampo in modo che la matrice non si deteriori.
Una tasca nella forma dello stampo desiderata verrà fabbricata nella matrice extracellulare. Per caricare le cellule concentrare la sospensione cellulare sperimentale dopo la centrifugazione nell'apposito mezzo sperimentale di coltura cellulare e iniettare le cellule nella tasca all'interno della matrice extracellulare. Posizionare il cubo nell'incubatore di anidride carbonica per 20 minuti a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di cadere nella tasca della matrice extracellulare, riempiendo lo spazio creato dal micro stampo.
Alla fine dell'incubazione, posizionare il cubo in un pozzo di una piastra di 24 porri e aggiungere 100 microlitri del mezzo di coltura cellulare appropriato al pozzo. Iniettare ulteriore matrice extracellulare per chiudere la tasca e riportare il cubo all'incubatore per 25 minuti. Quando la matrice extracellulare viene polimerizzata, rilasciare circa 10 microlitri di agarosio Celsius di 20 gradi sulla superficie superiore del cubo per chiudere la superficie e curare la goccia per 10-20 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi coprire l'intero cubo con mezzo fresco per promuovere la pressione osmotica per facilitare il trasferimento della nutrizione alle cellule all'interno del cubo. Per il riconoscimento non invasivo della forma 3D mediante osservazione multidirezionale, posizionare la piastra su uno stadio di microscopio e ottenere immagini di ciascun lato del cubo mediante microscopia a campo luminoso o a contrasto di fase, utilizzando una pinzetta per ruotare il servizio del cubo da immagini tra le acquisizioni. Per l'imaging immunofluorescente mediante osservazione multidirezionale, aspirare prima il supernatante dal pozzo contenente il cubo e fissare il cubo in paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.
Al termine della fissazione, lavare il cubo due volte con PBS per 10 minuti per lavaggio. Impermeabilizzare il cubo con 0,5%tritone x-100 e PBS per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, lavare il cubo tre volte in PBS per 10 minuti per lavaggio, prima di bloccare qualsiasi legame non specifico con siero di capra e tampone di immunofluorescenza per 60 minuti a temperatura ambiente.
Quindi macchiare le cellule con l'anticorpo primario appropriato di interesse secondo i protocolli di colorazione degli anticorpi standard. Quindi immagini tutti e sei i lati del cubo su un microscopio laser o fluorescente come appena dimostrato. In questo esperimento rappresentativo l'imaging multidirezionale di cubi di gel ibridi, coltivati con normali cellule epiteliali bronchiali umane, dimostra la generazione di una coltura cellulare iniziale cilindrica o a forma di prisma per contrasto di fase e imaging immunofluorescente delle colture.
Qui viene mostrata la colorazione immuno delle normali cellule epiteliali umane inizialmente controllate a forma cilindrica nel cubo gel ibrido, dopo la generazione dell'albero bronchiale. I rami dimostrano la perpendicolare all'asse cilindrico, come rivelato dall'imaging multidimensionale. È importante iniettare un'alta densità di cellule nella tasca della matrice extracellulare, poiché una bassa densità di cellule può causare il deterioramento di quella qualità cellulare dopo l'incubazione.
Questo modello di metodo è la formazione ripetibile di un modello cellulare 3D con una misurazione quantitativa mediante imaging multidirezionale per studiare il meccanismo di sviluppo dei piatti.
