CMOD Pack consente di modellare le celle con altissima precisione e di coltivatele in 2d o 3d. Ciò apre opportunità per studiare le interazioni cellula-cellula e la morfogenesi dei nuovi tessuti motori. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da adottare per altri laboratori, non richiede una camera bianca, attrezzature specializzate o reagenti sintetizzati personalizzati.
Inizia facendo cadere piccole gocce della resistenza fotografica positiva sul vetrino di aldeide, usando una pipetta usa e getta. Ruotare la diapositiva a 3000 RPM per 30 secondi utilizzando lo spin coder, quindi posizionarla su una piastra riscaldante a 100 gradi Celsius per 1,5 minuti per collegare la resistenza alla foto. Rimuovere la diapositiva dalla piastra calda e posizionare una maschera fotografica con le caratteristiche desiderate sulla parte superiore della diapositiva, appesantirla con un pezzo di vetro e coprire l'intera configurazione in una scatola opaca.
Esporre la configurazione con una lampada UV per due minuti, sviluppare la diapositiva immergendola nella soluzione di sviluppo per tre-cinque minuti, quindi risciacquare la soluzione di sviluppo in eccesso con acqua, asciugarla sotto un flusso di aria o azoto. Osservare questa luce al microscopio per confermare il successo della litografia fotografica e conservarla al buio. Aggiungere una goccia di 20 micromolari ammina modificata soluzione oligos su ogni regione foto-modellata del vetrino e distribuire delicatamente la goccia su tutta la regione, usando una punta di pipetta, facendo attenzione, a non graffiare il vetrino, cuocere il vetrino in un forno a 65 gradi Celsius fino a quando la soluzione di DNA non si è completamente asciugata, eseguire un'aminazione riduttiva posizionando il vetrino cotto e un piatto di coltura cellulare di 15 centimetri in una cappa aspirante sopra di uno shaker.
Mescolare delicatamente 100 milligrammi di anidride boro di sodio in 40 millilitri di PBS e aggiungerlo al piatto. Quindi accendere lo shaker per 15 minuti. Dopo la reazione, lavare questo vetrino due volte con 0,1% di sodio dodecil solfato per rimuovere il DNA non reato.
Quindi lavare lo scivolo tre volte con acqua. Guida questa diapositiva sotto il flusso di azoto o aria. Infine risciacquare con acetone per rimuovere la resistenza fotografica rimanente.
Preparare una soluzione di ancoraggio e adattatore universale a quattro micromolari come descritto nel manoscritto di testo e preparare una soluzione di co-ancoraggio universale di 20 micromolari in PBS. Preparare la sospensione cellulare riconsoscendo il pellet cellulare in un millilitro di PBS ghiacciato o mezzo privo di siero e trasferire da una a 3 milioni di celle in una centrifuga a micro centrifuga da 1,5 millilitro. Centrifugare a 160 volte G per quattro minuti.
Riespendare il pellet di cella ottenuto in 75 microlitri di PBS ghiacciato o mezzi privi di siero e aggiungere 75 microlitri della soluzione universale di ancoraggio e adattatore preparata per micromolare. Mescolare accuratamente e incubare per cinque minuti sul ghiaccio, aggiungere 15 microlitri della soluzione universale di co-ancoraggio al tubo e mescolare accuratamente, quindi incubare il campione per cinque minuti sul ghiaccio. Per rimuovere gli oligo in eccesso dalla sospensione cellulare, aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato o mezzo privo di siero al tubo e mescolare con una pipetta.
Pellet le celle centrifugando a 160 volte G per quattro minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio altre due volte. Risuscindi le cellule in PBS di ghiaccio o in mezzi privi di siero per creare una soluzione densa di almeno 25 milioni di cellule per millilitro, inclina leggermente il vetrino del modello, quindi aggiungi 25 microlitri di questa sospensione cellulare all'ingresso di ciascuna cella di flusso.
Rimuovere la soluzione PBS e 1%BSA dall'uscita, consentendo alla sospensione cellulare di riempire la cella di flusso PDM. Incubare su ghiaccio o a temperatura ambiente per 30 secondi, aspirare cinque microlitri della sospensione cellulare dall'uscita del vetrino e aggiungerlo nuovamente nell'ingresso. Ripetete questa operazione 10 volte per cella di flusso.
Pipettare delicatamente PBS o supporti privi di siero nell'ingresso di ciascuna cella di flusso per lavare le cellule in eccesso e raccogliere la sospensione cellulare dall'uscita. Ripeti questo due o quattro volte fino a quando non rimangono celle in eccesso sul vetrino. Per la coltura 3d, preparare una soluzione precursore di idro gel contenente il 2% di DNA e aggiungerne 50 microlitri all'ingresso di ciascuna cella di flusso.
Aspirare il fluido in eccesso dall'uscita, guidando la soluzione di idrogel nella cella di flusso. Incubare il vetrino a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti per consentire agli idrogel di impostare e scindere l'adesione basata sul DNA tra le cellule e la superficie. Aggiungere 50 microlitri di precursore dell'idro gel a un pozzo di una slitta a due pozzetti o una piastra a sei pozzetti.
Pipetta 10 microlitri di PBS su entrambi i lati di ogni cella di flusso. Distribuiscilo lungo l'intera lunghezza della cella di flusso usando una lama di rasoio o trova una pinzetta di punto e solleva delicatamente i lati delle celle di flusso in modo che il PBS si precipiti sotto l'idro gel. Utilizzando una lama di rasoio, spostare la cella di flusso sul bordo della diapositiva invertendo la diapositiva e spingere la cella di flusso fuori dalla diapositiva in modo che atterri sulla parte superiore della lama di rasoio.
Prelevare la cella di flusso dalla lama di rasoio utilizzando una pinca curva. Invertire le cellule di flusso in modo che le cellule siano sul fondo e posizionarle sopra la goccia della soluzione precursore dell'idro gel. Incubare per almeno 30 minuti in modo che l'idrogel contenente le cellule del modello possa legarsi al sottofondo dell'idrogel con conseguente incorporamento completo delle cellule del modello.
Rimuovere la cella di flusso e immergerla completamente nel supporto. Spingere delicatamente la cella di flusso usando una pinca curva fino a quando non si stacca e galleggia nel supporto, quindi scartarla. La quantificazione dell'adesione della macchia del DNA alle cellule etichettate CMO, che aumenta.
in funzione della concentrazione di OCM è rappresentata come la deviazione media e standard da tre esperimenti. I modelli di DNA sono mostrati in magenta e le cellule cmotiche aderenti in ciano a diverse concentrazioni di CMO. Un confronto tra CMO etichettato huvecs e LMO etichettato huvecs aderente a un modello di DNA lineare è mostrato qui.
I singoli HDDC modello VSC MOD pack e trasferiti in gel maitre sono stati in grado di proliferare e polarizzare dopo cinque giorni di coltura. Gli aggregati multicellulari multistrato sono stati creati alternando strati di cellule etichettate con CMO complementari. Più popolazioni cellulari uniche possono essere modellate insieme con alta precisione e senza contaminazione incrociata.
Quando si tenta questo protocollo, è fondamentale avere una sospensione cellulare densa mentre si aggiungono le cellule al vetrino al fine di massimizzare le opportunità per le cellule di aderire alle macchie di DNA.
