Questi test possono essere utilizzati per valutare e confrontare le uscite immunitarie di diversi genotipi vegetali. Il vantaggio principale di queste tecniche è che sono rapide, affidabili e utilizzano attrezzature di laboratorio comuni. Per il test di inibizione della crescita, le piantine della stessa dimensione ed età devono essere trapiantate e completamente asciugate prima di pesare per limitare la variazione.
A quattro o cinque settimane dopo la germinazione, utilizzare un forte punzone di biopsia da quattro millimetri per rimuovere un disco fogliare per pianta di Arabidopsis, evitando il midvein e facendo attenzione a limitare le ferite. Raccogliere i dischi in singoli pozzi di una piastra luminometrica inutilizzata da 96 pozzi contenente 100 microlitri di acqua doppia distillata per pozzo, lato adassiale verso l'alto, per evitare l'essiccazione. Se si valutano più elicitori, rimuovere un secondo disco fogliare dalla stessa foglia per ogni trattamento di elicitor e coprire la piastra con il coperchio per consentire ai dischi fogliari di recuperare durante la notte a temperatura ambiente.
La mattina seguente, impostare i parametri del lettore di micropiatte su un tempo di integrazione di 1.000 millisecondi in intervalli di due minuti in un periodo di 40-60 minuti per catturare l'esplosione ossidativa dinamica. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per sostituire l'acqua in ogni pozzo con 100 microlitri di soluzione di reazione preparata al momento, incluso un controllo, nessuna reazione di elicitor per ogni genotipo per valutare i livelli delle specie di ossigeno di reazione basale in assenza di eccitazione. Quindi, misurare immediatamente l'emissione luminosa per tutte le lunghezze d'onda nello spettro visibile sul lettore di micropiatte.
A quattro giorni dalla post-germinazione, caricare ogni pozzo di una piastra da 48 porri con 500 microlitri di mezzo MS integrati con una diluizione di peptide elicitore. Successivamente, utilizzare forcep sterili per trapiantare con cura da sei a otto piantine della stessa dimensione, età e genotipo in ogni diluizione peptidica, facendo attenzione che non ci siano danni alla piantina o alla rottura alla radice e che la radice sia sommersa nel mezzo. Quando tutte le piantine sono state placcate, sigillare le piastre con nastro Micropore e posizionare le piante in condizioni standard di breve giorno per otto-12 giorni.
Per determinare l'inibizione della crescita percentuale, scatta una foto per registrare visivamente l'inibizione della crescita prima di rimuovere attentamente le piantine da ogni pozzo. Quindi, tamponare le radici su un tovagliolo di carta per asciugare e pesare ogni piantina su una scala analitica. In questo esperimento rappresentativo, le piante mutanti con segnalazione immunitaria iperattiva hanno dimostrato un'esplosione ossidativa cumulativa e media più elevata rispetto alle piante arabidopsis di tipo selvatico, mentre le piante mutanti con segnalazione immunitaria compromessa hanno mostrato un'esplosione ossidativa ridotta a concentrazioni tra 10 e 1.000 nanomolari.
Le differenze previste nell'inibizione della crescita delle piantine potrebbero anche essere individuate tra tutti i genotipi coltivati in concentrazioni peptidiche di elicitor nanomolare 100 e 1.000 nanomolari. Quando sono cresciuti nella diluizione peptidica nanomolare 1.000, i mutanti con segnalazione immunitaria iperattiva erano marcatamente più piccoli delle piante di tipo selvatico coltivate nelle stesse condizioni, mentre i mutanti con segnalazione immunitaria compromessa mostravano una debole inibizione della crescita rispetto alle piante di tipo selvatico. Questi metodi forniscono prove di risposte immunitarie precoci e tardive.
Molte altre tecniche, tra cui i test MAP chinasi, l'espressione genica indotta da agenti patogeni e i test di infezione, possono essere utilizzate per delineare queste vie. Queste tecniche sono state modificate per l'uso in schermi su larga scala, che hanno identificato con successo proteine del recettore patogeno e molti altri componenti di segnalazione.
