La sonda CFDA ampiamente utilizzata, o abbreviazione di carbossifluoresceina diacetato, non è fluorescente. I due gruppi H3 e la posizione 3'6'su questo composto lo rendono permeante alla membrana. Dove una volta all'interno delle cellule, gli acetati cellulari interni rimuoveranno i gruppi di acetati e rilasceranno la nuova forma di CFDA.
Questa è una carbossifluoresceina, o CF, che è fluorescente. E poiché questa nuova forma è meno permeante alla membrana, il peso, tutte le cellule devono muoversi attraverso i pori intercellulari, o la plasmodesmata nelle piante, questo sta facendo diacetato la sonda ideale per studiare il trasporto intercellulare nell'attività del phloem. Nel video di oggi, dimostreremo il caricamento del CFD nella radice e nell'ipocotil delle piante arabidopsis, rispettivamente, e mostreremo come le due procedure leggermente diverse influenzeranno il movimento dal basso verso l'alto di questa sonda fluorescente.
Ottenere risultati di colorazione in modo coerente, immagazzinamo i semi arabidopsis raccolti in quattro gradi Celsius, armadio di umidità al 40%. I semi appena raccolti conservati in questa condizione per più di sette giorni sono prontamente utilizzati per la semina. Per garantire che ogni pianta sia coltivata in uno spazio relativamente simile nella piastra di Petri, stiamo usando una scheda di grado della zona dei semi.
Ora, bagnando la punta sterilizzata, immergere nei semi sterilizzati e seminare i semi uno per uno nella posizione designata. Dopo aver finito la semina, sigillare la piastra di Petri con parafilm e un nastro adesivo, metterli su un supporto per piastre di Petri per lasciarlo crescere verticalmente. Ecco gli strumenti che useremo in questo esperimento.
Si prega di notare che è meglio caricare il colorante il più rapidamente possibile. Normalmente, finisci l'intero processo in 10-15 minuti. Prima di eseguire l'esperimento di caricamento CFDA, prepariamo sempre una nuova soluzione CFDA.
Qui, diluire il CFDA millimolare in cinque concentrazione micromolare con acqua prima dell'uso immediato. Tagliare il parafilm in piccoli pezzi in tre per tre millimetri. Poiché c'è condensa sul coperchio e sul fondo della piastra di Petri, dobbiamo cancellarli con un tovagliolo di carta per evitare che la tintura fluisca.
Un piccolo pezzo di parafilm viene messo sotto la radice. Sollevare le piante e metterle sul coperchio. Tagliare le radici da cinque a 10 millimetri sotto l'ipocotile.
Riporta le riprese sui piccoli pezzi di parafilm. Ora applicare con cura un microlitro CFDA sull'estremità di taglio della radice. Cerca di evitare di contaminare tutte le proto-piante.
Quindi coprire il coperchio, quindi lasciarli nella sala di crescita per due ore. Metodo di pizzicamento ipoccotile. Il piccolo pezzo di parafilm, come precedentemente preparato, viene messo sotto la giunzione radice-ipocotile.
Usiamo un encefaloce per pizzicare delicatamente l'ipocotile vicino al tessuto radicale e applichiamo con cura CFDA a 0,1 microlitri sul lato pizzicato e lasciamo la pianta per due ore. Le foto da nove a 12 giorni dopo le piante di colorazione della zona. Tutti mostrano il modello di colorazione vascolare sia nei cotyledons che nelle vere foglie.
Solo in un caso molto raro, la foglia di cotiledone mostrava un motivo di colorazione a mezza foglia. Quindi, fondamentalmente, i due metodi non hanno fatto la differenza nel modello di colorazione CF, tuttavia se eseguiamo il carico di coloranti in sempre più piante, troviamo che le due procedure danno una differenza significativa di efficienza. Con il metodo root-cut, circa il 70% delle piante mostra il segnale fluorescente nelle riprese.
Ma l'efficienza può essere aumentata al 91% utilizzando il metodo di pizzicamento dell'ipocotile. Abbiamo anche provato il metodo di avvicinamento delle radici, ma questo metodo si traducono in un'efficienza ancora inferiore, è di circa il 30%Pertanto, sembra che il modo di caricare il colorante non tenga conto della differenza di colorazione. La differenza molto probabilmente sta nei siti di carico, che potrebbero essere separati da una barriera simbioplastica.
Abbiamo mostrato come carichiamo il CFDA nelle radici arabidopsis e nell'ipocotile. Abbiamo usato due procedure leggermente diverse, e queste due procedure leggermente diverse si traducono in una differenza significativa in questo movimento della sonda dal basso verso l'alto. Suggeriamo che questo metodo potrebbe aiutarci a identificare una potenziale barriera simbioplastica per i segnali sparanti derivati dalle radici.
