Questo sensore di tensione integrativa basato sul DNA, o ITS, che converte il segnale di forza in fluorescenza localmente consente l'imaging diretto della forza cellulare con microscopia a fluorescenza. Its ha un'alta risoluzione spaziale e un'alta sensibilità. La soglia di attivazione è tonnibile, consentendo un'immagine selettiva della tensione dell'integrina a diversi livelli.
Dopo aver ricevuto il DNA a singolo filamento personalizzato, o ssDNA, di interesse, per coniugare il peptide RGD al quencher di ssDNA tiolato, aggiungere prima 100 microlitri di EDTA 0,5 molare in 400 microlitri di acqua a circa 450 microlitri di soluzione TCEP appena preparata. Quindi, aggiungere 10 microlitri della soluzione TCEP-EDTA a 20 microlitri di quencher di DNA tiolo millimolare in PBS per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Per coniugare l'ammina RGD con sulfo-SMCC, aggiungere 40 microlitri di solfato-SMCC da 23 millimolare appena preparato a 100 microlitri di soluzione di ammina RGD da 11 millimolare preparata al momento per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente.
Per coniugare l'ammina RGD SMCC con il quencher di ssDNA tiolato, mescolare l'intero volume della soluzione di quencher di ssDNA tiolata con l'intero volume della soluzione SMCC di ammina RGD per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, trasferire la soluzione allo stoccaggio di quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, mescolare il cloruro di sodio trimolare con la soluzione di DNA coniugato al tiolo e meno 20 gradi Celsius, refrigerato, 100% etanolo con un rapporto uno-10-25, e posizionare la reazione a meno 20 gradi Celsius per circa 30 minuti.
Quando il DNA è precipitato, raccogliere il DNA per centrifugazione e rimescolare il pellet nel PBS per misurare la concentrazione di DNA su uno spettrometro. Per la sintesi del sensore di tensione integrativo, o ITS, mescolare le soluzioni di DNA a filamento superiore e inferiore a un rapporto 1,1-molare e incubare la reazione durante la notte a quattro gradi Celsius prima di posizionare aliquote della miscela a meno 20 gradi Celsius per lo stoccaggio a lungo termine. Per l'immobilizzazione ITS, rivestire una piastra di Petri con fondo di vetro di 29 millimetri di diametro con 200 microlitri di albumina di siero bovino biotinilata da 0,1 milligrammi per millilitro, o BSA-biotina, per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Quando la BSA-biotina si è fisicamente assorbita sulla superficie del vetro, lavare il piatto tre volte con 200 microlitri di PBS fresco per lavaggio, seguito da incubazione con 200 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di proteina avidina per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il piatto tre volte con PBS come dimostrato e aggiungere 200 microlitri di ITS 0,1 micromolare per un'altra incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il piatto tre volte con PBS, lasciando l'ultimo lavaggio nel piatto fino alla placcatura cellulare.
Per avviare una coltura di cheratociti di pesce, utilizzare una pinzetta a punta piatta per strappare un pezzo di scala da un pesce e premere delicatamente la bilancia sul pozzo di una piastra di Petri con fondo di vetro non modificato, con il lato interno della bilancia che contatta il vetro. Attendere circa 30 secondi affinché la scala del pesce aderisca alla superficie in vetro del piatto prima di coprire la bilancia con un millimetro di mezzo dulbecco modificato completo di Iscove. Quindi, incubare la bilancia in una scatola scura e umida per sei-48 ore a temperatura ambiente.
Per placcare i cheratociti sulla superficie ITS, sostituire il mezzo dal piatto di coltura del cheratocita con una soluzione di staccamento cellulare 1X per un'incubazione di tre minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione di distacco con un mezzo fresco e completo e dissociare le cellule con una tubazione delicata. Quindi, regolare le cellule alla concentrazione appropriata per la placcatura e seminarle sul piatto rivestito ITS per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'imaging.
Per l'imaging della tensione dell'integrina quasi in tempo reale nelle cellule vive, trasferire le cellule allo stadio di un microscopio a fluorescenza e selezionare l'obiettivo 40 o 100 volte. Nel software di imaging, impostare il tempo di esposizione su un secondo e l'intervallo di fotogrammi di 20 secondi per ottenere un video delle immagini ITS. Quindi, utilizzare un programma software di analisi delle immagini appropriato per sottrarre un fotogramma precedente del video ITS da un fotogramma corrente per calcolare il segnale ITS appena prodotto nell'ultimo intervallo di fotogrammi.
Il segnale ITS di nuova produzione rappresenta la tensione di integrina generata nell'ultimo intervallo di fotogrammi, segnalando così la forza cellulare in modo quasi in tempo reale. Qui, la mappatura della tensione dell'integrina dimostra l'induzione della tensione dell'integrina in due tracce di forza durante la migrazione dei cheratociti. La risoluzione della mappa di forza potrebbe quindi essere calibrata per essere di 0,4 micrometri.
L'alta tensione dell'integrina si concentra sul margine posteriore nei cheratociti di pesce motile. Nelle cellule nonmotili si forma uno specifico schema di tensione dell'integrina che è molto diverso da quello osservato nel cheratocita migratore veloce. Le aderenze focali e la tensione dell'integrina dei cheratociti di pesce possono essere co-immagini per valutare la relazione tra tensione dell'integrina e struttura cellulare nelle cellule di interesse.
Con l'ITS, la forza di adesione cellulare diventa visibile con una risoluzione e una sensibilità paragonabile all'imaging strutturale cellulare. Questa tecnica apre la strada allo studio di un'interazione forza-struttura nelle cellule.
