Questo protocollo aiuta a stabilire la connessione tra forza molecolare e comportamento di rotolamento cellulare oltre a consentire di mappare e quantificare spazialmente l'adesione al rotolamento a livello molecolare. Questa tecnica permette di studiare i singoli eventi di adesione durante il rotolamento cellulare effettivo permettendoci di misurare direttamente la forza di adesione molecolare fisiologicamente rilevante. La preparazione della superficie utilizzando la concentrazione e il tempo di incubazione appropriati in ogni fase è fondamentale per ottenere una funzionalizzazione superficiale di alta qualità.
Anche la qualità delle bioconiugazioni e le condizioni adeguate sono cruciali. La dimostrazione visiva è fondamentale per aiutare i ricercatori a replicare questo protocollo. In particolare, le fasi come l'assemblaggio della camera di flusso e la post-elaborazione delle immagini trarranno grande beneficio da una dimostrazione visiva.
Inizia stendendo sottilmente una piccola quantità di resina epossidica su entrambi i lati del nastro biadesivo con una lama di rasoio. Utilizzando un laser, tagliare il nastro rivestito con resina epossidica per creare quattro canali. Create il chip di flusso inserendo il nastro epossidico tra una slitta a quattro fori e una slitta di copertura PEG.
Utilizzando una punta della pipetta, applicare una leggera pressione lungo la lunghezza dei canali per creare una buona tenuta, quindi polimerizzare la resina epossidica per un minimo di un'ora. Allineare il chip in modo che l'apertura di ciascun canale sia posizionata al centro dell'adattatore. Quindi posizionare due distanziali acrilici trasparenti sulla parte superiore del chip.
Applicare una pressione decisa al centro del blocco e avvitare alle estremità di ciascun distanziatore. Avvitare gli ingressi nei fori filettati sull'altro lato della staffa e monitorare le condizioni di tenuta attraverso il blocco acrilico trasparente. Flusso 200 microlitri di tampone di lavaggio nella camera per verificare la presenza di perdite.
Se si formano bolle nel canale, spingere aggressivamente altri 200 microlitri di tampone di lavaggio per rimuovere le bolle. Aggiungere 40 microlitri di BSA alla camera di flusso per evitare legami non specifici e incubare per 10 minuti nella camera di umidità. Dopo l'incubazione, aggiungere 40 microlitri a Tween 20 alla camera di flusso e di nuovo incubare per 10 minuti per ridurre ulteriormente il legame non specifico.
Quindi lavare il canale con 200 microlitri di tampone di lavaggio per rimuovere tutti gli agenti di passivazione. Per la funzionalizzazione della superficie della camera, aggiungere 40 microlitri di Streptavidin alla camera di flusso e incubare per 20 minuti, quindi lavare la camera con 200 microlitri di tampone di lavaggio. Ora, aggiungi 40 microlitri di proteina ibridata G-TGT alla camera di flusso e incuba per 20 minuti.
Dopo il lavaggio con tampone di lavaggio, aggiungere 40 microlitri di proteina G-TGT top strand e incubare per 20 minuti per completare qualsiasi filamento inferiore TGT non ibridato sulla superficie e quindi lavare con tampone di lavaggio. Infine, aggiungere 40 microlitri di P-selectin-Fc alla camera di flusso e incubare per 60 minuti prima del lavaggio con tampone di lavaggio. Riempire una siringa di vetro da cinque millilitri con il tampone di rotolamento e picchiettare i lati della siringa per rimuovere e spingere fuori le bolle mentre galleggiano verso la punta.
Dopo aver inserito un ago sterile in un pezzo di tubo di polietilene da 200 millimetri, collegare l'ago alla siringa di vetro. Fissare la siringa sulla pompa della siringa e inclinare la pompa della siringa in modo che il lato dello stantuffo sia sollevato per evitare che le bolle d'aria entrino nel canale. Inserire l'estremità del tubo nell'ingresso della camera di flusso.
Inserire un'estremità di un altro pezzo da 200 millimetri del tubo di polietilene nell'uscita e immergere l'altra estremità in un becher di scarto. Prelevare da uno a due millilitri del campione di sospensione cellulare e centrifugare per pellettare le celle. Rimuovere il mezzo e risospese delicatamente le celle in 500 microlitri del tampone di rotolamento.
Scollegare con cura il tubo dalle prese e l'uscita e la pipetta 40 microlitri della sospensione cellulare nella camera di flusso. Ricollegare il tubo come descritto in precedenza assicurandosi che le bolle non vengano introdotte nel canale di flusso. Iniziare l'esperimento di laminazione cellulare avviando la pompa della siringa alle portate desiderate.
Osserva il rotolamento cellulare usando un microscopio a campo oscuro con un obiettivo 10X. Una volta completato l'esperimento, rimuovere le celle dal canale infondendo il tampone di rotolamento a 100 millilitri all'ora fino a quando la superficie non è libera da celle. Per l'imaging delle tracce locali tramite DNA-PAINT, aggiungere al canale 40 microlitri di filamento imager DNA-PAINT preparato nel buffer DNA-PAINT.
Eseguire la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale utilizzando le condizioni menzionate nel manoscritto di testo. Localizza ed esegui il rendering delle immagini a super risoluzione. Per l'imaging delle tracce lunghe mediante etichettatura permanente, aggiungere il filamento imager permanente e incubare per 120 secondi nel buffer T50M5.
Quindi lavare il canale infondendo 200 microlitri di tampone di lavaggio. Registrare un'immagine con il laser di eccitazione spento per ottenere il rumore di fondo della telecamera. Immagine di una vasta area in un modello a griglia mediante microscopia TIRF.
Programmare il microscopio per scansionare l'area di 400 per 50 immagini e dividere i dati grezzi in singoli file TIP contenenti ciascuno un massimo di 10.000 immagini utilizzando il programma ImageJ. Appiattisci tutte le immagini utilizzando il profilo di illuminazione e utilizza il plugin MIST per cucire le immagini. Il risultato per la caratterizzazione della bioconiugazione della proteina G ssDNA ha mostrato un rapporto quasi uno a uno tra proteina G e ssDNA in cui la proteina G Maleimide ssDNA e gli spettri tampone di eluizione imidazolica dalla base ortogonale per adattarsi allo spettro di prodotti di bioconiugazione.
La PAGE nativa è stata utilizzata per confermare la bioconiugazione che mostra le bande verde brillante che coincidono con la banda G della proteina monomerica che indica un successo della coniugazione e una buona resa. Il profilo di illuminazione TIRF introdotto da una fibra monomodale è generalmente più luminoso al centro del campo visivo e dimmer attorno ai bordi. Per compensare l'illuminazione irregolare e appiattire le immagini per l'analisi quantitativa, il profilo di illuminazione è stato determinato facendo una media di migliaia di singoli fotogrammi.
Le immagini appiattite sono state prodotte sottraendo il rumore della fotocamera sia dai profili raw che da quelli di illuminazione e quindi normalizzandosi dal profilo di illuminazione. Le cuciture grezze mostravano chiari modelli periodici corrispondenti alle immagini non corrette, mentre lo stesso campo visivo cucito da immagini appiattite produceva uno sfondo piatto. È stato utilizzato un profilo di flusso ramp up per determinare l'intervallo di sforzo di taglio con conseguente rotolamento delle celle e tracce di fluorescenza di resa sotto le quali è stato possibile vedere una tipica impronta di adesione a cella singola.
Vengono mostrati risultati non ottimali e ottimali di tracce fluorescenti con contrasto insufficiente, densità di traccia eccessiva, densità e contrasto di traccia ottimali e diffrazione limitata e imaging DNA-PAINT. Il tempo di incubazione superiore a 60 minuti garantisce la funzionalizzazione della superficie e la corretta costruzione della camera impedisce il passaggio di bolle che danneggiano la superficie funzionalizzata. Questa procedura è applicabile per l'analisi quantitativa della forza molecolare coinvolta nell'adesione al rotolamento e consente ai ricercatori di comprendere il comportamento di rotolamento dei diversi tipi di cellule.
Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare nuove domande riguardanti gli eventi di adesione rapida che portano a un ulteriore progresso della ricerca sulla singola molecola e sulla meccanobiologia.
