Le cellule aderenti esercitano forze sull'ambiente circostante, e tali forze includono le forze che le cellule esercitano sul substrato, mostrate qui in verde, e le forze che le cellule esercitano sui loro vicini, mostrate in rosso. Queste forze possono essere misurate in monostrati cellulari utilizzando una tecnica chiamata microscopia da sforzo monostrato. In breve, la tecnica prevede la preparazione di idrogel contenenti minuscole perle fluorescenti, appena sotto la superficie superiore, e grandi perle fluorescenti incollate al vetro.
Su questo idrogel, si vedono le cellule e le si coltiva alla confluenza o in qualsiasi stato si desideri misurare le forze. La misurazione delle forze richiede l'imaging del monostrato cellulare, l'acquisizione di immagini di luce trasmessa delle cellule e immagini di luce fluorescente delle piccole e grandi perle. Ognuna di queste immagini viene acquisita nello stesso piano vocale.
Queste immagini vengono acquisite quando le cellule sono attaccate e staccate dall'idrogel. E un confronto di questi due insiemi di immagini ci fornisce i dati necessari per quantificare tutte queste forze. È qui che entrano in gioco AcTrM e AnViM.
Dopo aver placcato le celle, per acquisire immagini nella stessa identica posizione, in qualsiasi istanza desiderata, quel protocollo viene programmato in AcTrM e quindi analizzare successivamente questi dati e visualizzare i risultati, questo è lo scopo di AnViM. Nei prossimi minuti, ti guideremo attraverso il processo di acquisizione di immagini per un monostrato di celle di confluenza. Il passaggio zero dell'azione richiede all'utente di selezionare il tipo di acquisizione.
Una nuova acquisizione per iniziare un nuovo esperimento o un'acquisizione continua per riprendere un esperimento precedente. Fare clic su Fresh Acquisition per creare un elenco di posizioni. Il primo passo dell'azione elenca tutti i passaggi successivi.
E queste azioni verranno intraprese nella finestra dell'elenco delle posizioni dello stage qui. Fare clic su Live in Micro-Manager per visualizzare l'esempio per le regolazioni manuali. In live view, vedremo la fase.
Qui è chiaro. Ora, si dovrà guardare le perline. Qui, le perline possono essere visualizzate in fluorescenza.
Quindi seleziona il canale appropriato per le perline superiori. È anche importante che tu sia in grado di vedere alcune perline inferiori, quindi diamo un'occhiata a un canale per le perline inferiori. Quello che vedi qui è un'immagine sfocata di perline in basso, e va benissimo finché puoi dire che le perline in basso sono lì, cosa che puoi in questa immagine.
Elenco posizione, fare clic su Contrassegna. Questo è il modo in cui si crea un elenco di posizioni. Dopo aver creato un elenco di posizioni, illustrato nel video precedente, seguire i passaggi elencati nel secondo passaggio dell'azione utilizzando la finestra di acquisizione multidimensionale.
Diciamo che vogliamo eseguire un lungo time-lapse. Qui, indicherò il numero di immagini che vogliamo che vengano scattate. Il primo canale sarà il canale di fase.
Il prossimo sarà delle perline superiori e quello dopo sarà il perline inferiori. Fare clic su Chiudi nella finestra di acquisizione multidimensionale e fare clic su OK nel secondo passaggio di AcTrM. L'output verrà salvato nella directory identificata nella finestra di acquisizione multidimensionale.
Il terzo passo dell'azione chiederà se l'esperimento ha bisogno di recupero. La risposta sarà in genere sì. Qui iTACS chiede, vogliamo eseguire un recupero raffinato?
Questa prima porzione ci porterà abbastanza vicino a una ripresa raffinata, ma la parte inferiore ci avvicinerà ancora di più a una maggiore precisione di riposizionamento. Se il ripristino verrà eseguito utilizzando un campo visivo limitato, viene offerta questa opzione, ma per questo esperimento non selezioneremo tale opzione. A questo punto, l'acquisizione di un set di immagini di riferimento è completa e Micro-Manager può essere chiuso.
Per l'acquisizione di immagini, si avvierà AcTrM. Selezionare l'ingrandimento e scegliere la directory che contiene le cartelle di dati. Selezionare le scelte per il riposizionamento della piastra insieme al canale utilizzato per il riposizionamento.
Viene fornita un'interfaccia per abbinare ciò che è attualmente visto nella fotocamera con le immagini salvate. In caso di sovrapposizione, le immagini mostreranno un colore rosso e verde insieme al nero e sarà possibile eseguire la regolazione manuale. In caso contrario, premi accetta e l'acquisizione procederà.
Ora possiamo iniziare FIJI. Selezionare la prima opzione nel menu a discesa MSM con l'etichetta di pre-elaborazione. Quindi, selezionare la cartella contenente la cartella tnimgs.
Successivamente, dovremo definire quale canale corrisponde a quale immagine. Per questo esempio, il canale 0 è l'immagine della luce trasmessa che è l'immagine a contrasto di fase delle celle. L'immagine del tallone inferiore è il canale 2 e l'immagine del tallone superiore è il canale 1.
E poi, ti sta chiedendo dove si incrociano le cellule e da che parte dell'immagine. In questo caso, le celle sono un monostrato che avanza verso il bordo destro, quindi deselezioneremo Destra e continueremo. Qui una piccola regione di perline superiori, situata lontano dal monostrato, ha lo stesso scopo delle immagini di perline inferiori che apparirebbero più sparse e più grandi di quelle mostrate qui.
Ora ci sta chiedendo se vogliamo cambiare la luminosità e il contrasto in modo che le perline appaiano in modo prominente. Quindi ci adattiamo usando le barre di scorrimento nel menu e, una volta che le perline appaiono prominenti, fare clic su OK. E ora, faremo la correzione della posizione. Se c'è qualche cambiamento, se ne libererà.
E al termine, creerà la cartella di analisi. All'interno della cartella di analisi, creerà la cartella di posizione, P0, e le scelte che abbiamo fatto nei precedenti menu di pre-elaborazione sono memorizzate nelle scelte di analisi, come quali bordi sono stati incrociati, dimensioni dei pixel e quale immagine è contrasto di fase e altri. Nel menu a discesa microscopia a sforzo monostrato o MSM, selezionare deformazione del gel MSM.
Da qui, selezioneremo l'opzione adatta alla nostra distribuzione di perline. E mentre i dati vengono elaborati, puoi vedere che una nuova cartella di spostamento è apparsa nella cartella posizione. Questo sarà dove verranno archiviati tutti i file di output.
Ciò indica che l'analisi è completa. Vedremo come calcolare le forze che vengono esercitate attraverso la giunzione cellula-ECM e la giunzione cellula-cellula e anche il citoscheletro delle singole cellule del monostrato. Per questo, seleziona la terza opzione.
E si sceglierà la directory che contiene tnimgs e la cartella di analisi, il che significa che si selezionerà la directory di esempio piuttosto che una di queste directory. Premi seleziona e ti chiederà, qual è il modulo di taglio di questo gel? Il modulo di taglio è 1250 e lo spessore dell'idrogel in questo esempio è di 118 micron.
Il livello di rumore previsto è fornito qui. Quindi, c'è uno spostamento medio è zero flag, che non viene controllato in questo caso. Seleziona OK e l'implementazione che calcola la trazione viene eseguita tramite una funzione MATLAB, che è il modo in cui viene implementata in questa versione di AnViM.
Ora è pronto per fare il calcolo per le forze cellula-cellula o citoscheletriche. E la prima domanda da porsi è: il monostrato è confluente? In questo caso particolare, abbiamo un monostrato che avanza e non c'è una regione cellulare sul lato destro del telaio.
Quindi la risposta è che il monostrato non è confluente, quindi diremo di no. Ora ci viene chiesto di disegnare un poligono attorno al più grande oggetto non cellulare. Selezioniamo i metodi appropriati per la segmentazione.
Qui ci sta chiedendo di indicare il colore delle celle nei metodi tre e quattro, quindi qui le celle sono nere quindi sceglieremo il nero. La segmentazione prodotta da questi diversi metodi termina con alcuni fori nel monostrato cellulare e alcune regioni bianche nell'area senza cella. Qui possiamo scegliere, riempire automaticamente i punti e premere OK.So ora tutti i punti sono riempiti nel monostrato e nessuna area cellulare.
E poi, calcoleremo le sollecitazioni meccaniche nel monostrato cellulare. Abbiamo già eseguito la prima parte in cui abbiamo segmentato le cellule dalla regione senza cellule, quindi iniziamo questo passaggio con la seconda parte che è la segmentazione delle singole cellule e delle immagini. Uno selezionerà la segmentazione per le singole celle.
E qui ci sta chiedendo di scegliere la directory delle posizioni. E ci sono alcune altre informazioni fornite qui per questi parametri. Quindi ti chiede di disegnare un poligono attorno alla cella normale più piccola.
Quindi ciò che si disegna qui viene utilizzato per calcolare l'area e stabilirà che qualsiasi cosa più piccola di questa non è definita come una cella. E poi chiede la cella più grande. Quindi disegniamo un poligono attorno alla cella normale più grande, e poi chiede, quale è più luminoso?
L'interfaccia cellula-cella è più luminosa o i centri cella sono più luminosi? Quindi, in questo caso, l'interfaccia cella-cella è più luminosa, quindi selezionerò l'interfaccia cella-cella. Quindi questo indica che il calcolo è stato completato.
Iniziamo selezionando la mappa sulle intensità delle celle. Innanzitutto, iTACS chiede all'utente di selezionare la directory di posizione, nota anche come cartella P0. Al termine, fare clic su Seleziona.
Quindi all'utente viene chiesto se vuole che iTACS rilevi la divisione cellulare o quantifichi la fluorescenza cellulare. In questo caso, non abbiamo proteine fluorescenti all'interno della cellula, quindi è per questo che sceglieremo di rilevare la divisione cellulare. La diapositiva successiva consente all'utente di definire la dimensione della regione vicina, questa è un'analisi unica che AnViM esegue dove esamina le proprietà delle singole celle e le proprietà delle celle vicine.
Qui, l'utente può scegliere la larghezza di una cella vicina all'area. In questo caso, definiamo le regioni vicine con 60 pixel. La prima casella di controllo chiede se vogliamo che iTACS raccolga le proprietà delle celle, sì, e questa casella di controllo chiede se vogliamo che iTACS raccolga le proprietà dei vicini, sì, vogliamo che iTACS faccia anche questo.
Sotto queste caselle di controllo, iTACS fornisce ulteriori informazioni sulle caselle di controllo se l'utente desidera maggiori dettagli su ciascuna casella di controllo. Ciò indica che l'analisi è completa. Ancora una volta, iTACS chiede all'utente di selezionare la directory di posizione.
Quindi, all'utente viene data la possibilità di mappare i dati di forza, creare immagini dei dati di forza, mappare i dati di velocità e creare immagini dei dati di velocità. È importante notare che la creazione di immagini richiede tempo, quindi si può scegliere di farlo ora o aspettare di farlo in seguito. Ecco perché all'utente viene data la possibilità di selezionare le scelte o meno.
Qui, iTACS chiede all'utente di determinare nuovamente la dimensione della regione vicina e puoi utilizzare la stessa dimensione che hai determinato per le intensità di mappatura, che era di 60 pixel, nel nostro caso. E ancora, all'utente viene chiesto di raccogliere le proprietà delle celle e della regione limitrofa. Ciò indica che l'analisi è completa.
Nel menu a discesa microscopia a stress monostrato o MSM, selezionare i dati di traccia dei risultati. Innanzitutto, iTACS chiede all'utente di selezionare la directory di posizione, nota anche come cartella P0. Al termine, fare clic su Seleziona.
Qui, iTACS chiede da quale numero di frame l'utente desidera che iTACS inizi a tracciare i dati. È abbastanza sicuro iniziare il tracciamento dal fotogramma numero due, perché la velocità non può essere determinata per il fotogramma numero uno. Qui, iTACS chiede all'utente di indicare il numero massimo di trame da riempire contemporaneamente.
Ed essenzialmente, questo è un modo per accelerare il tracciamento dei dati. Al termine, fare clic su OK e le opzioni per la scelta delle variabili durante il monitoraggio vengono presentate in modo simile alle opzioni per la generazione di mappe di calore. Le proprietà comuni di interesse sono fornite nella casella di testo nella parte superiore della finestra.
Ma se desideri personalizzare le tue variabili, devi semplicemente eliminare tutto nella casella di testo e selezionare le proprietà specifiche elencate di seguito. Nel menu a discesa microscopia a sforzo monostrato o MSM, selezionare il grafico dei risultati. Successivamente, iTACS chiede all'utente se l'utente desidera limitare il plottaggio alle celle con traccia ininterrotta.
Se non si desidera limitare il plottaggio alle tracce ininterrotte, fare clic su No.Ma se si desidera limitare il plottaggio alle celle con tracce ininterrotte, fare clic su Sì Qui iTACS chiede quante variabili l'utente desidera che il programma tracci. iTACS è in grado di tracciare fino a tre variabili e, in questo caso, tracceremo solo due variabili per vedere la relazione tra questi fattori. Nel menu a discesa microscopia a stress monostrato o MSM, selezionare l'immagine dei risultati.
Ecco la directory delle posizioni e, al termine, fai clic su Seleziona. iTACS ci chiede quindi di scegliere il telaio di partenza. Qui, abbiamo selezionato il fotogramma numero due.
Le opzioni per la creazione di mappe di calore sono presentate in modo simile alle opzioni per tracciare le tracce temporali delle singole celle. Con ciò, concludiamo come creare una mappa di calore. Qui rappresenta la traccia temporale della velocità cellulare nella tensione citoscheletrica per la cellula numero uno.
Le proprietà vengono visualizzate su un asse verticale condiviso e l'asse orizzontale indica il numero di istanza temporale, in cui i fotogrammi vengono acquisiti a intervalli di 15 minuti. Il secondo output è una serie di mappe di calore a un'ora dall'inizio dell'esperimento. Le proprietà mostrate qui includono area di diffusione, orientamento, circolarità, velocità, direzione del movimento, orientamento alla massima tensione, tensione citoscheletrica, trazioni del substrato e anisotropia di tensione delle singole cellule.
Quindi questo è uno sguardo in una serie di esperimenti. Ci sono molte altre situazioni sperimentali in cui AnViM e AcTrM possono aiutare l'utente a fare l'esperimento in modo riproducibile e questi contatti sono elencati nel manoscritto. Alcune delle caratteristiche chiave di iTACS includono l'automazione del protocollo sperimentale, l'analisi automatizzata dei dati e non è richiesto alcun background ingegneristico.
