Il metodo è significativo perché consente il rilevamento neurochimico ad alta risoluzione spaziale e temporale che può potenzialmente migliorare i metodi in vivo di rilevamento neurochimico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo rapido, facile e riproducibile per migliorare la sensibilità e la risoluzione temporale del rilevamento del neurotrasmettitore. A dimostrare la procedura saranno Sanuja Mohanaraj e Pauline Wonnenberg, studenti laureati del mio laboratorio.
Per iniziare, separare il materiale in fibra di carbonio in singoli filamenti e estrarre una singola fibra di carbonio di sette micrometri di diametro da un trefolo. Collegare una linea di vuoto a un capillare di vetro borosilicato e aspirare la fibra di carbonio nel capillare. Quindi tagliare un pezzo di cartone di 10 centimetri per 25 centimetri per fungere da supporto per elettrodi.
Nastro un tovagliolo di carta intorno al cartone come supporto, quindi inserire il capillare nel supporto dell'elettrodo e fissarlo con cura in un estrattore capillare verticale. Configurare l'estrattore capillare per tirare il capillare di vetro su un cono fine per i materiali degli elettrodi e avviarlo. Una volta che la trazione termina e la bobina di riscaldamento si è raffreddata, tagliare la fibra di carbonio collegando gli elettrodi tirati a tubo.
Rimuovere con cura i microelettrodi dall'estrattore capillare. Guidati da uno stereoscopio o da un microscopio, utilizzare una lama affilata o forbici chirurgiche per tagliare la fibra di carbonio sporgente su ogni elettrodo a circa 100-150 micrometri di lunghezza. Successivamente, in una fiala da 25 millilitri, utilizzare un batuffolo di cotone per mescolare 10 grammi di epossidico con 0,2 millilitri di indurente.
Riempire un'altra fiala con acetone. Per ogni elettrodo, immergere la punta in fibra di carbonio in epossidica per 15 secondi e quindi immergerla in acetone per tre secondi per rimuovere l'epossidico in eccesso. Dopo l'epossidico, gli elettrodi epossidi vengono polimerizzati in forno per tre ore a 125 gradi Celsius.
Successivamente, utilizzare un micromanipolatore per posizionare un microelettrodo in fibra di carbonio in un elettrodo di riferimento in cloruro d'argento-argento in una soluzione di 0,5 millimolare di acido cloroaurico in cloruro di potassio acquoso molare 0,1. Collegare gli elettrodi a un potenziostato con un microelettrodo in fibra di carbonio come elettrodo di lavoro. Scansionare l'elettrodo da 0,2 volt a meno un volt a 50 millivolt al secondo per 10 cicli per eseguire la deposizione dell'elettrodo.
È fondamentale ottimizzare i parametri per il deposito del rivestimento in oro. Un troppo rivestimento causerà rumore e sovraccarico del segnale, mentre un rivestimento troppo piccolo non migliorerà il rilevamento neurochimico. Prima del test, preparare una soluzione di 10 millimolare di dopamina nell'acido perclorico e circa un litro di tampone a base di PH 7.4 PBS in acqua deionizzata.
Pipettare un microlitro della soluzione di stock di dopamina in 10 millilitri di tampone per fare una soluzione di dopamina micromolare circa. Quindi collegare un microelettrodo in fibra di carbonio e un elettrodo di riferimento in cloruro argento-argento a un potenziostato. Fissare l'elettrodo in fibra di carbonio e l'elettrodo di riferimento nella fase della testa dell'apparato della cella di flusso e utilizzare il micromanipolatore per abbassarli nella cella di flusso.
Disegnare 60 millilitri del tampone PBS in una siringa. Riempire la cella di flusso con il tampone e montare la siringa in una pompa per siringhe. Iniziare a scorrere il buffer attraverso la cella di flusso a una velocità di un millilitro al minuto.
Quindi configurare il potentiostato per la scansione per meno 0,4 volt a 1,3 volt a 10 hertz e 400 volt al secondo. Applicare brevemente la forma d'onda al microelettrodo, osservare l'oscilloscopio e regolare il guadagno per evitare il sovraccarico. Lasciare equilibrare il microelettrode per 10 minuti nel buffer.
Quindi disegnare la soluzione diluita di dopamina in una siringa e collegarla alla porta di iniezione della cellula di flusso. Impostare il tempo di esecuzione totale sul potenziostato su 30 secondi. Iniziare a registrare le misurazioni, attendere 10 secondi, quindi iniettare 0,2 millilitri di soluzione di dopamina nella cellula di flusso.
Al termine dell'esecuzione, elaborare i dati con un software di analisi della voltammetria ciclica ad alta definizione. Lasciare che il microelettrodo si ri-equilibra per 10 minuti prima di eseguire un altro test. Al termine delle prove, pulire la cella di flusso iniettando tre millilitri di acqua e tre millilitri di aria nel tampone e nelle porte di iniezione tre volte.
Le fibre di carbonio rivestite sono state immagini con microscopia elettronica a scansione. Lo spessore e la dimensione delle particelle dei rivestimenti delle nanoparticelle d'oro possono essere controllati dal tempo di deposizione dell'elettrodo. 20 minuti di deposizione di elettrodi hanno prodotto uno spesso rivestimento in oro con creste affilate mentre cinque minuti hanno prodotto un sottile rivestimento in oro uniforme.
I microelettrodi rivestiti di nanoparticelle d'oro in fibra di carbonio avevano correnti ossidatrici di picco significativamente più elevate e una cinetica di trasferimento degli elettroni più veloce rispetto agli elettrodi non modificati. Il rivestimento della nanoparticella d'oro non ha avuto alcun effetto significativo sulla stabilità delle risposte degli elettrodi come dimostrato qui in una soluzione di dopamina. Sia gli elettrodi rivestiti di nanoparticelle nude che d'oro hanno risposto linearmente ai cambiamenti della velocità di scansione con una grandezza molto maggiore del cambiamento negli elettrodi rivestiti in oro.
Ciò indicava che l'assorbimento della dopamina poteva essere controllato attraverso la velocità di scansione. Elettrodi rivestiti di nanoparticelle sia bare che oro hanno risposto linearmente tra concentrazioni di dopamina da 100 nanomolari a 10 micromolari. Una curva asintotica è stata osservata a concentrazioni più elevate, indicando che la dopamina è supersatura sulla superficie dell'elettrodo.
La capacità di rilevare i cambiamenti neurochimici su una scala di tempo più veloce e a sensibilità più elevate aiuterà a rispondere a domande complesse nelle neuroscienze. Questo metodo ha anche usi in chimica analitica, metabolomica e scienze ambientali. Sebbene sia facile da imparare, la dimostrazione visiva è fondamentale per imparare a creare, modificare e testare i microelettrodi.
Le direzioni future per questo metodo includono la regolazione della deposizione di oro e altri rivestimenti per tenere conto dello spessore, delle dimensioni, della forma e della morfologia per ottimizzare il rilevamento di neurotrasmettitori specifici. I ricercatori dovrebbero esercitarsi a maneggiare piccole fibre al microscopio prima di provare questa tecnica. Inoltre, la soluzione di stock di neurotrasmettitori deve essere preparata in una cappa aspirante perché utilizza 1 acido perclorico molare.
