Questo modello murino di infrazione miocardica consente il monitoraggio dei processi patologici che si verificano dall'occlusione coronarica all'insufficienza cardiaca in fase avanzata al tessuto cardiaco locale e ai livelli sistemici. Questo metodo è compatibile con qualsiasi lettura attualmente utilizzata in biologia cardiaca e fisiologia. Inoltre, beneficia dell'immensa diversità dei modelli genetici murini.
L'acquisizione di adeguate capacità chirurgiche può richiedere tempo per essere padroneggiata. Questa procedura è meglio appresa passo dopo passo con un ricercatore esperto. La dimostrazione visiva di questo modello murino consente la condivisione di suggerimenti che possono aiutare con la procedura chirurgica e accelerare il processo di apprendimento.
Usa un rasoio elettrico per radere rapidamente un topo anestetizzato, da 25 a 30 grammi, maschio, C57-Black / 6 sulla gola e sul lato sinistro della gabbia toracica. Confermare la mancanza di risposta al dito del dito. Applicare un unguento agli occhi dell'animale.
Posizionare il mouse in posizione supina su una pastiglia riscaldante e posizionare una piccola garza compressa sotto la testa per evitare il surriscaldamento degli occhi. Fissare gli arti con nastro adesivo. Passare un anello di sutura di seta 5-0 sotto gli incisivi superiori e fissare l'estremità dell'anello sul riscaldante per mantenere la bocca aperta durante la cannulazione.
Applicare la crema depilatoria sulle aree pre-rasate e massaggiare delicatamente con un batuffolo di cotone per un minuto. Rimuovere la pelliccia e la crema in eccesso con garza e pulire la pelle esposta con gocce di soluzione salina allo 0,9% e garza. Applicare pezzi di garza sterile sulla gola rasata e sul torace e immergere la garza con iodopovidone.
Impostare il ventilatore a un volume di marea di sette millilitri per chilogrammo e una velocità di ventilazione di 140 corse al minuto. Spostare il mouse al microscopio stereo della microchirurgia. Tenendo la pelle al centro della gola, fare un'incisione di 0,5 centimetri lungo la linea caudale / cefalica e separare i lobi della ghiandola salivare.
Utilizzare forcep curve per separare delicatamente la fascia del muscolo sternoioide fino a quando la laringe e la trachea non sono visibili. Quindi fissare i bordi dell'apertura con retrattiri attaccati a fasce elastiche. Quindi, tirare delicatamente la lingua lateralmente e utilizzare le pina per inserire l'ago interno smussato di una cannula calibro 16 nella trachea.
Visualizzare un corretto inserimento nella trachea attraverso l'incisione della gola e collegare la cannula al ventilatore. Posizionare la soluzione salina sterile allo 0,9% integrata con garza imbevuta di iodopovidone sull'incisione per mantenere i tessuti bagnati durante l'operazione. Quindi posizionare i tubi di scarico in acqua.
La presenza di bolle indica un'intubazione riuscita. Per la legatura dell'arteria coronarica discendente anteriore sinistra, o LAD, spostare attentamente il mouse nella posizione del decubito laterale destro e riorridire l'arto anteriore sinistro nella nuova posizione. Identificare la linea tra il pettorale sinistro minore e i muscoli maggiori e fare un'incisione obliqua della pelle di un centimetro lungo la linea.
Utilizzando micro forbici smussate, separare la fascia dei muscoli pettorali senza incisione dei tessuti e utilizzare retrattili attaccati a fasce elastiche per mantenere la separazione. Impostare il ventilatore con una pressione end-espiratoria positiva di tre centimetri d'acqua. Utilizzare le forcep smussate per aprire la cavità toracica nel terzo spazio intercostale tra la terza e la quarta costola.
Posizionare due retrattili nella gabbia toracica, uno su ogni costola, e utilizzare una forcep fine curva per rimuovere con cura il pericardio senza danneggiare il cuore e i polmoni. Individuare il LAD come una linea rossa brillante superficiale che corre dal bordo del padiglione auricolare sinistro verso l'apice. Utilizzare un portaaghi per passare una sutura di seta 7-0 sotto il LAD da due a tre millimetri sotto gli atri sinistro.
Tirando lentamente la seta per evitare di strappare il tessuto cardiaco, legare la legatura con tre nodi. La parte in basso a sinistra del ventricolo sinistro impallidisce istantaneamente dopo la legatura. Ora rilascia i retrattili delle costole e tenendo la terza costola con le forcep, fai due passaggi con una sutura di seta 6-0 sotto la terza e la quarta costola.
Posizionare tre gocce di soluzione salina 37 gradi Celsius allo 0,9% sull'apertura e chiudere il tubo di scarico di scadenza per due o tre cicli respiratori per gonfiare correttamente i polmoni. Stringere e fissare la sutura con due tiri e rilasciare i retrattori che tengono i muscoli, aiutando i muscoli a tornare alla loro corretta posizione anatomica. Quindi chiudere la pelle toracica con due punti e due tiri di seta sutura 5-0.
Chiudi la pelle della gola con un punto di seta sutura 5-0 e due tiri. Alla fine della procedura, rimuovere le fasce di nastro dagli arti, ruotare attentamente l'animale in decubito ventrale sul tampone di compressione e posizionare un impacco sul pad riscaldante sul lato destro dell'animale. Iniettare per via intraperitoneale 0,3 millilitri di soluzione di glucosio riscaldata al 5% da 37 gradi Celsius.
Ferma il ventilatore. Se il topo respira spontaneamente, rimuovere cautamente la cannula. Iniettare per via sottocutanea 0,1 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina.
Posizionare il mouse in una gabbia Celsius di 30 gradi ventilata con ossigeno al 100% per almeno un'ora con monitoraggio. Durante i due primi giorni successivi all'intervento chirurgico, fornire al topo una dieta morbida e acqua ad libitum, riscaldando l'animale se necessario. Sette giorni dopo l'intervento chirurgico, le aree ischemiche rimangono incontaminate dal cloruro di trifeniltetrazolo, mentre il tessuto vivo macchia di rosso a causa della presenza di deidrogenasi.
Le aree ischemiche possono quindi essere calcolate come percentuale di area bianca del ventricolo sinistro in un programma software di imaging. L'analisi western della macchia per l'actina muscolare alfa-liscia e la fosforilazione SMAD2, che sono rispettivamente le principali letture dei miofibroblasti e dell'attivazione della segnalazione beta del fattore di crescita, può essere utilizzata per determinare l'estensione della fibrosi all'interno del tessuto miocardico dei cuori infarti. L'analisi della reazione a catena della polimerasi in tempo reale della trasformazione del fattore di crescita beta e la sua espressione di mRNA bersaglio a valle possono anche essere eseguite per valutare la presenza di fibrosi miocardica.
Le vie di segnalazione pro-infiammatorie e l'espressione di geni pro-infiammatori si trovano tipicamente attivate entro la prima settimana successiva all'infarto del miocardio. si osserva anche l'espressione di mRNA di geni pro-infiammatori e marcatori monociti/macrofagi. L'altezza di legatura influenzerà criticamente la sopravvivenza e dovrebbe essere adattata a ciascun ceppo o genotipo, poiché la ramificazione del LAD può variare.
Le costanti nella legatura sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili. Questa procedura può essere accoppiata con qualsiasi metodo analitico e può essere seguita da analisi funzionale, fissazione dei tessuti, coltura cellulare o qualsiasi tecnica di interesse.
