Questo protocollo misura i livelli di ubiquitinazione delle proteine subcellulari e l'attività proteasome nel cervello dei roditori consentendo all'interno dei soggetti confronti di come l'attività ubiquitina-proteasome cambia in risposta all'attività cellulare, all'apprendimento o alle malattie. Il protocollo consente la raccolta di frazioni sinaptiche, citoplasmatiche e nucleari dallo stesso cervello di roditori. Riducendo al minimo la perdita, potrebbe essere eseguita con piccole quantità di tessuto e attrezzature di laboratorio di base.
A dimostrare la procedura sarà Taylor McFadden, una studentessa laureata del mio laboratorio. Inizia questa procedura con la raccolta e la dissezione del tessuto cerebrale dei roditori come descritto nel protocollo di testo. Assicurarsi che l'emisfero utilizzato sia controbilanciato tra le condizioni di estrazione per ogni gruppo sperimentale.
Rimuovere il microtubo di centrifuga da 1,5 millilitri contenente un emisfero della regione di interesse dal congelatore meno 80 gradi Celsius. Usando un bisturi, trasferire il tessuto cerebrale congelato in un omogeneizzatore teflon in vetro da due millilitri. Aggiungere 500 microlitri di tampone dilisi al tubo di Teflon.
Usando il pestello B, omogeneizzare lo stesso tessuto con 15 colpi fino a quando non è presente alcuna quantità visibile di materiale solido. Utilizzate un movimento di tornitura durante ogni tratto. Con una pipetta da 1.000 microlitri, trasferire il campione omogeneizzato in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Posizionare il tubo sul ghiaccio bagnato e incubare per 30 minuti. Posizionare il tubo nel microcentrifugo e girare per 10 minuti a 845 volte g in quattro gradi Celsius. Dopo il completamento, rimuovere con cura il supernatante tubazione e posizionare in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Questa è la frazione citoplasmatica. Aggiungere 50 microlitri di tampone di estrazione al pellet risultante e rimostrare mediante pipettazione. Non vortice il pellet.
Posizionare il tubo contenente il pellet rimorsificato sul ghiaccio e incubare per 30 minuti. Quindi centrifugare il tubo per 20 minuti a 21,456 volte g in quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il supernatante tubazione e posizionarsi in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Questa è la frazione nucleare. Omogeneizzare un emisfero della regione di interesse come in precedenza, ad eccezione dell'uso di 500 microlitri di buffer TEVP anziché di buffer di lisi. Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, trasferire il campione omogeneizzato in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Centrifugare il campione a 1.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il supernatante e trasferirlo su un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri. Centrifugare il campione a 10.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il pellet originale che contiene nuclei e detriti di grandi dimensioni. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri. Questa è la frazione citosolica.
Aggiungere 50 microlitri di tampone di omogeneizzazione al pellet e rimorsi mediante pipettazione fino a quando non è visibile alcun materiale solido. Centrifugare il campione a 20.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Questa è la frazione grezza della membrana sinaposomica. Per impostare il saggio, prewarm il lettore di piastre a 37 gradi Celsius e tenere attraverso la corsa. Impostare l'eccitazione a 360 nanometri e l'emissione a 460 nanometri.
Se la piastra del pozzo 96 utilizzata è chiara, impostare la posizione dell'ottica sul fondo. Se si utilizza una piastra scura da 96 pozza, impostare la posizione ottica verso l'alto. Programma un'esecuzione cinetica con un tempo di scansione di due ore ogni 30 minuti.
Ricostituire il tampone di dosaggio 20S 10X fornito nel kit con 13,5 millilitri di acqua ultrapura. Aggiungere 14 microlitri di ATP da 100 millimolare all'ormai 1X buffer. Ciò migliora significativamente l'attività proteasome nei campioni e migliora l'affidabilità del saggio.
Ricostituire lo standard AMC fornito nel kit con 100 microlitri di DMSO. Eseguire i passaggi utilizzando lo standard AMC al buio o in condizioni di scarsa illuminazione in quanto lo standard è sensibile alla luce. Creare una curva standard di AMC da una serie di concentrazioni AMC da alte a basse.
Questa curva verrà utilizzata per la calibrazione del lettore di lastre e l'analisi dell'attività proteasome nei campioni omogeneizzati. Ricostituire il sottotrato proteasome fornito nel kit con 65 microlitri di DMSO. Eseguire anche questo passaggio al buio o in condizioni di scarsa illuminazione in quanto il substrato è sensibile alla luce.
Quindi creare una diluizione da uno a 20 del substrato proteasome in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri utilizzando il tampone di dosaggio 20S. Aggiungere una quantità normalizzata dei campioni desiderati a una piastra di 96 pozza. Eseguire ogni campione in duplicato.
La quantità di campione necessaria varia in base alla preparazione dei tessuti. Generalmente, da 10 a 20 microgrammi è sufficiente per qualsiasi frazione subcellulare. Portare il volume del pozzo del campione a 80 microlitri con acqua ultrapura.
La quantità aggiunta dipende dal volume del campione aggiunto. In due pozzi separati, aggiungere 80 microlitri di acqua da soli. Questi saranno gli spazi vuoti del saggio.
Aggiungere 10 microlitri di tampone di dosaggio 20S a ciascun pozzo, inclusi gli spazi vuoti di dosaggio. Utilizzare un ripetitore o una pipetta automatizzata per garantire un volume di dosaggio costante attraverso i pozzi. Spegnere le luci o entrare in una stanza buia.
Aggiungere tutti i 100 microlitri di standard AMC diluiti a un nuovo pozzo utilizzando un unico pozzo per ogni standard. Al buio, utilizzare un ripetitore o una pipetta automatizzata per aggiungere 10 microlitri di substrato proteasome diluito a pozzi contenenti campioni e spazi vuoti di dosaggio, ma non lo standard AMC. Posizionare la piastra nel lettore di lastre e iniziare la corsa cinetica.
Eseguire la quantificazione di diversi tag di poliubiquitina in diverse frazioni subcellulari raccolte dal tessuto cerebrale dei roditori utilizzando una varietà di protocolli di gonfiore occidentali standard in combinazione con anticorpi poliubiquini specifici del collegamento unici. Alcune immagini macchie occidentali ubiquitina forniranno colonne di bande distinte, mentre altre producono motivi simili a strisci con poche o nessuna linea chiara. Per la quantificazione dell'ubiquità immagine nelle macchie occidentali, disegnare una scatola attorno alla colonna che estende l'intera scala degli standard molecolari.
Regolare la scatola se la colorazione dell'ubiquitina si estende attraverso l'intera scala. Questo è comune per le modifiche alla lsina 48 e varia ampiamente tra i compartimenti subcellulari. Infine, sottrarre lo sfondo che viene calcolato come densità ottica media dello sfondo che circonda immediatamente la colonna su tutti i lati.
Qui è mostrata la quantificazione dell'attività proteasome in diverse frazioni raccolte dall'amigdala laterale dello stesso animale. Durante il saggio di attività proteasome in vitro, le unità fluorescenti relative rilevate sono aumentate dall'inizio alla fine del saggio nella frazione sinaptica, nella frazione citoplasmatica e nella frazione nucleare. L'inibitore del proteasome beta-lac impediva alle RFU di cambiare durante la sessione.
Differenze subcellulari sono state osservate nell'attività proteasome nell'amigdala laterale dello stesso animale. Un aumento dell'attività del proteasome nucleare è stato rilevato negli animali addestrati rispetto ai controlli che corrispondevano ad una diminuzione dell'attività all'interno della frazione sinaptica. L'attività del proteasome citoplasmatico è rimasta al basale.
Qui sono mostrate differenze subcellulari nell'ubiquitinazione proteica specifica del collegamento nell'amigdala laterale dello stesso animale dopo l'apprendimento. C'è stato un aumento dell'ubiquitinazione complessiva nella frazione nucleare dopo l'apprendimento che si è correlato con una diminuzione della frazione citoplasmatica. Dopo l'apprendimento, l'ubiquitinazione lineare è aumentata nella frazione nucleare ma non nelle frazioni citoplasmatiche o sinaptiche.
È interessante notare che l'ubiquitinazione del K63 è aumentata nella frazione nucleare dopo l'apprendimento che si è correlato con una diminuzione della frazione sinaptica. Mentre l'uniquitinazione del K48 è aumentata nelle frazioni nucleari e citoplasmatiche dopo l'apprendimento, ma non nella frazione sinaptica. Questo protocollo può anche essere usato per comprendere la distribuzione subcellulare e la funzione di altre proteine all'interno dello stesso animale.
