Questo protocollo è significativo perché consente la quantificazione di due proteine nella stessa regione cerebrale. Questo permette allo sperimentatore di guardare l'attività nelle vie di segnalazione molecolare nelle regioni cerebrali saggiando pan e fosfoproteine. Può anche essere usato per saggiare proteine che sono marcatori di diversi fenomeni cognitivi.
Stiamo usando una tecnica relativamente semplice, come l'immunoistochimica, per rispondere a domande che in genere richiedono tecniche più coinvolte. Compreso l'esame dell'attività delle vie di segnalazione molecolare, l'esame del rapporto AMPA/NMDA. Utilizzando un criostato mantenuto tra meno 9 gradi Celsius e meno 12 gradi Celsius, tagliare il cervello di ratto precedentemente isolato e congelato in regioni di interesse a 30-50 micrometri.
Montare direttamente le fette su vetrini e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'immunocitochimica. Rimuovere i vetrini dal congelatore e consentire loro di equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavorando sotto una cappa aspirante, posizionare gli scivoli in paraformaldeide al 4% in PBS molare da una a due ore a temperatura ambiente per la fissazione dei tessuti.
Quindi sciacquare le diapositive in 0,1 TBS molare tre volte per 10 minuti ciascuna. Per permeabilizzare le membrane cellulari, incubare le diapositive in un detergente delicato per 30-60 minuti. E risciacquare di nuovo in TBS tre volte per 15 minuti ciascuno.
Diluire l'anticorpo primario per proteine di interesse per pbs nella corretta concentrazione come descritto nel manoscritto. Soluzione di anticorpi primari pipetta direttamente sul tessuto cerebrale. Posizionare gli scivolamenti di copertura sulle diapositive e incubare il tessuto cerebrale nella diluizione degli anticorpi primari per 1-2 ore a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, rimuovere le foglietti di copertura e lavare gli scivoli in TBS che ha una piccola quantità di detergente aggiunto, quattro volte per 15 minuti ciascuno. Diluire l'anticorpo secondario in un diluente contenente TBS, detergente e l'1,5% del siero ospite. Aggiungere anticorpi secondari alle diapositive, coprire con scivolamenti di copertura e incubare a temperatura ambiente per due ore.
Dopo l'incubazione, sciacquare le diapositive in TBS-T quattro volte per 20 minuti ciascuna e quindi in TBS quattro volte per 20 minuti ciascuna. Asciugare gli scivoli a temperatura ambiente al buio, durante la notte. Posizionare le diapositive sull'interfaccia di scansione del vicino infrarosso con il tessuto rivolto verso il basso.
Immagini più diapositive alla volta usando lo strumento di selezione. Immagini le diapositive utilizzando l'impostazione di altissima qualità con una risoluzione di 21 micrometri. In un offset di zero nanometri, importare immagini nel software di analisi delle immagini per visualizzare e contrassegnare per l'analisi semiquantitativa delle proteine.
Dopo aver aperto il software di analisi delle immagini, selezionare l'area di lavoro in cui è stata digitalizzata l'immagine. Quindi apri l'immagine digitalizzata nel software di analisi delle immagini per visualizzare la scansione e regolare le lunghezze d'onda, il contrasto, la luminosità e l'ingrandimento mostrati senza alterare l'immagine grezza o l'emissione quantificata totale. Dopo aver identificato le aree chiave per la quantificazione, selezionare la scheda analisi nella parte superiore della pagina, quindi selezionare disegna rettangolo per disegnare un rettangolo sull'area che verrà quantificata.
Per visualizzare le dimensioni del rettangolo, selezionare le forme in basso a sinistra dello schermo. Quindi selezionare le colonne in basso a destra. Aggiungere quindi colonne di altezza e larghezza per identificare le dimensioni della forma.
Infine, denominare la forma e ripetere. Una volta campionare tutte le aree, procedere con la combinazione e l'analisi dei dati disponibili nella scheda colonne. Per verificare che questo protocollo funzioni, le sezioni cerebrali sono state incubate con anticorpi primari e secondari, solo anticorpi secondari o né anticorpi primari né secondari.
L'espressione precoce del gene c-jun immediato è stata rilevata nell'ippocampo dorsale e nell'amigdala solo quando gli anticorpi primari e secondari sono stati applicati al tessuto cerebrale. La sotto-unità GluR1 del recettore AMPA e la sotto-unità NR2A del recettore NMDA sono state testate nel rilevamento delle proteine delle feci nei nuclei di amigdala. Ciò ha permesso di esaminare il rapporto dei recettori NMDA AMPA nei sotto-nuclei dell'amigdala che è una firma neurobiologica dell'apprendimento e della memoria.
Misure media e normalizzate dell'espressione proteica sono state ottenute da scansioni ad alta risoluzione nell'ippocampo ventrale. Utilizzando il software di analisi delle immagini, un rettangolo viene posizionato nella regione di interesse e l'intensità media della luce dalla forma è stata utilizzata come misura dell'espressione del fluoroforo, che è una misura dell'espressione proteica. Per ottenere la curva normalizzata, una forma è stata posizionata attraverso una regione che esprime un segnale elevato e un segnale basso nell'area sotto la curva è stata utilizzata come misura dell'espressione proteica.
La più grande lotta con questa procedura è trovare un anticorpo e assicurarsi che funzioni. L'applicazione è semplice. Il mio consiglio sarebbe quello di tentare prima una normale procedura immunoistochimica, poi provare questa tecnica.
Eseguire sempre prima un test di convalida. La cosa più importante da ricordare è controllare la diluizione degli anticorpi e assicurarsi che sia applicata correttamente. Senza questi passaggi, la procedura fallirà.
