Questo protocollo permette di valutare l'ubiquitilazione di un substrato specifico da parte di una ligasi E3. Sappiamo che la caratterizzazione dell'interazione ligasi-substrato è fondamentale per comprendere la loro funzione nelle cellule. Questa tecnica non richiede reagenti costosi o apparecchiature sofisticate.
Ha bisogno di plasmidi e codifica dei geni di interesse, sviluppando un test di immunoprecipitazione con lisati cellulari e un Western blot per rilevare l'ubiquitilazione del substrato. Diverse malattie umane come il cancro e disturbi neurologici sono associate alla disregolazione della ligasi E3. Quindi, l'identificazione dell'ubiquitilazione del substrato da parte di specifiche ligasi E3 potrebbe aiutare nel trattamento o nella diagnosi di tali malattie.
A dimostrare la procedura sarà di Valentine Spagnol. Per iniziare, coltiva la linea cellulare HEK293T fino all'80-90% di confluenza nel mezzo Eagles modificato di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale e 100 unità di penicillina, 100 microgrammi di streptomicina e 0,292 milligrammi per millilitro di L-glutammina. Quindi, incubare questa coltura a 37 gradi Celsius in un incubatore di colture cellulari umidificate al 5% di anidride carbonica.
Passare le cellule aspirando il terreno dal piatto di coltura usando una pipetta sierologica e lavarle una volta con un millilitro di PBS 1X sterilizzato. Quindi, staccare le cellule aggiungendo un millilitro di soluzione di acido etilendiamminotetraacetico di tripsina e dopo cinque minuti di incubazione a 37 gradi Celsius, risospese queste cellule in due millilitri di mezzi di crescita usando una pipetta sierologica. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri fresco e pulito e centrifugare a 500 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi, rimuovere delicatamente il surnatante e risospesciare il pellet cellulare in tre millilitri di terreno di crescita pipettando su e giù per ottenere una sospensione cellulare omogenea. Quindi, trasferire un millilitro di questa sospensione cellulare in un piatto di coltura trattato TC da 100 millimetri contenente nove millilitri di mezzi di crescita. Prima della trasfezione, certificare se le cellule sono esenti da contaminazione e ad una confluenza adeguata per le trasfezioni transitorie.
Per ogni campione di trasfezione, preparare i complessi DNA-polietileneimina diluendo tre microgrammi di ciascun plasmide in 100 microlitri di mezzo sierico ridotto Opti-MEM 1 senza integrazione e mescolandolo delicatamente pipettando la soluzione su e giù. Quindi, scongelare il DNA-polietilenemina a temperatura ambiente e aggiungerlo nella soluzione seguendo una proporzione di tre microlitri di DNA-polietileneimmina per un microgrammo di DNA. Omogeneizzare la soluzione tubando su e giù.
Quindi, incubarlo per 15 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione di complessi DNA-polietileneimina. Aggiungere il volume totale dei complessi DNA-polietileneimina a ciascun piatto contenente la coltura cellulare e mescolarlo delicatamente facendo oscillare la piastra avanti e indietro. Quindi, incubare queste cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di colture cellulari umidificate.
Dopo l'incubazione e sei ore prima della lisi cellulare, trattare le cellule trasfettate con l'inibitore del proteasoma 10-micromolare MG132 e incubare le cellule nell'incubatore di colture cellulari umidificate. Quindi, aspirare il materiale da ogni piatto di coltura usando una pipetta sierologica e lavare le cellule una volta con un millilitro di 1X PBS. Quindi, staccare le cellule aggiungendo una tripsina millilitro e incubare il piatto a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Risospesere le cellule in un millilitro di terreno di crescita e trasferire la sospensione cellulare in un microtubo da due millilitri fresco e pulito e centrifugarla a 500 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Una volta terminata la centrifugazione, rimuovere il surnatante versandolo con cura e risospesci delicatamente il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone di lisi MP40 ghiacciato integrato con il cocktail inibitori della proteasi e della fosfatasi. Quindi trasferire questa soluzione in un microtubo pulito da 1,5 millilitri.
Incubare questo lisato cellulare per 30 minuti sul ghiaccio e, dopo l'incubazione, centrifugare i lisati cellulari a 16.900 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Nel frattempo, equilibrare le perle anti-HA di agarosio con un tampone di lisi MP40 ghiacciato. Utilizzare 15 microlitri di perline anti-HA di agarosio per ogni campione.
Lavare le perline con 200 microlitri di tampone di lisi MP40 pulsandole in un tubo di microcentrazione a 3.000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius. Quindi, aspirare e scartare accuratamente il surnatante con una pipetta e ripetere questo processo tre volte. Successivamente, mantenere le perline equilibrate sul ghiaccio fino all'uso.
Dopo aver centrifugato i lisati cellulari, recuperare il surnatante e quantificare il contenuto proteico nel lisato totale utilizzando il metodo Bradford per garantire che ogni campione sottoposto a immunoprecipitazione presenti una quantità uguale di proteine. Incubare il volume necessario di lisato cellulare con le perle anti-HA di agarosio bilanciate per quattro ore, ruotando delicatamente in un incubatore rotante a quattro gradi Celsius, che consente all'UXT-V2-HA di legarsi alle perle anti-HA di agarosio. Raccogliere le perle anti-HA di agarosio pulsandole in un tubo microcentrifuga a 3.000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius.
Aspirare con cura ed scartare il surnatante. Lavare le perline tre volte con tampone di lisi cellulare MP40 ghiacciato e due volte con tampone FLAG HA ghiacciato. Dopo il lavaggio finale, rimuovere accuratamente tutto il surnatante usando una pipetta ed eluire la proteina poli-ubiquitilata con 300 microgrammi per millilitro di peptide HA diluito sul tampone FLAG HA.
Incubare le perle anti-HA di agarosio con peptide HA per un'ora a quattro gradi Celsius in una piattaforma shaker a dondolo. Quindi, abbassare le perline a 3.000 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere con attenzione il surnatante contenente le proteine poli-ubiquitinate. Se necessario, conservare l'eluente in un microtubo fresco e pulito a meno 20 gradi Celsius.
Risolvere gli eluenti e i lisati cellulari in 10% sodio dodecil solfato poliacrilammide gel elettroforesi e immunoblotting. Per eseguire un western blotting a trasferimento umido, posizionare il gel in un sandwich di trasferimento composto da carta da filtro, carta da filtro a membrana gel, ammortizzarlo con cuscinetti e premerlo insieme da una griglia di supporto. Quindi, posizionare questo sistema verticalmente in un serbatoio pieno di buffer di trasferimento tra elettrodi in acciaio inossidabile o filo di platino.
Il trasferimento avviene per 90 minuti a 150 volt in un buffer di trasferimento bagnato. Infine, sondare la membrana immunoblot utilizzando anticorpi anti-myc. La poli-ubiquitilazione specifica di UXT-V2-HA mediata dalla proteina F-box 7 nelle cellule è stata osservata dopo aver sondato l'eluente dall'immunoprecipitazione anti-HA con un anticorpo anti-myc, che rileva il myc-ub coniugato al substrato.
La specificità dell'anti-myc per il substrato poli-ubiquitilato è stata visualizzata nelle corsie uno e due, in cui uno striscio di proteine poli-ubiquitilate non è stato rilevato quando le cellule sono state co-trasfettate con la proteina F-box 7 e myc-ub in assenza di plasmide UXT-V2-HA. Inoltre, non è stato visualizzato alcuno striscio corrispondente alla poli-ubiquitinazione proteica nella combinazione di proteina F-box 7 e UXT-V2-HA senza il plasmide myc-ub. Quando un mutante 7 della proteina F-box wild-box a vettore vuoto o della proteina F-box 7 incapace di assemblare SCF attivo è stato transettato in combinazione con UXT-V2-HA e myc-ub, un forte segnale di striscio di UXT-V2 poli-ubiquitilato è stato osservato solo per la proteina F-box 7 wild-type, suggerendo che UXT-V2 era poli-ubiquitilato dal complesso SCF F-box protein 7 e cellule rispetto ai controlli.
Le fasi di mono-precipitazione, compresa l'incubazione dei lisati cellulari con le perle equilibrate e l'eluizione di proteine immunoprecipitate sono essenziali per raggiungere l'obiettivo di questo protocollo. Dopo questa procedura, deve essere eseguito un test di ubiquitilazione in vitro per confermare la specificità dell'ubiquitilazione del substrato da parte della ligasi E3.
