Questo protocollo è significativo perché può essere utilizzato per interrogare i repertori immunitari dei donatori umani per identificare cellule B rare e specifiche dell'antigene. Questa tecnica ci consente di ottenere catene pesanti e leggere accoppiate nativamente, che possono essere rapidamente clonate, e quindi testate direttamente contro l'antigene o gli antigeni di interesse. A dimostrare la procedura sarà Mike Morton, un tecnico del nostro laboratorio.
Almeno un'ora dopo lo scongelamento e il recupero, raccogliere il PBMC donatore per centrifugazione. E sospendere di nuovo le cellule in 50 millilitri di MES Buffer ghiacciato per il conteggio. Pellettizzare le cellule con un'altra centrifugazione e isolare le cellule B positive cd22 mediante selezione positiva con microperline CD22 secondo protocolli standard.
Raccogliere le cellule cd22-positive isolate per perline mediante centrifugazione e rimossare le cellule a quattro volte 10 alla settima cellule per millilitro di concentrazione tampone Vax. Aggiungere un cocktail anticorpale IgG CD19 CD27 alle cellule secondo le raccomandazioni di diluizione del produttore con miscelazione delicata e aliquota 10 alla settima parte in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri per il controllo negativo. Aggiungere un tetramero di steptavidina di biotina a doppia etichetta al tubo di controllo negativo ad una concentrazione finale di 36 nanomolari ciascuno con un PE e un APC, moltiplicato per il numero di peptidi nel tubo di ordinamento.
Portare il volume finale in ogni tubo 2,5 millilitri con tampone Vax fresco e aggiungere i tetrameri peptidici allo smistamento del tubo a 36 nanomolari ogni PE e APC. Dopo la centrifugazione, portare le cellule a due volte 10 al 6 ° per 100 microlitri di concentrazione di TBS per un'incubazione da 30 a 60 minuti, al buio, a quattro gradi Celsius, con rotazione. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte in tampone TBS fresco per lavaggio prima di filtrare i campioni in singoli tubi filtrante a cinque millilitri.
Macchiare i campioni con una concentrazione finale micromolare di DAPI 0,3 come marcatore dell'integrità della membrana cellulare. Ed eseguire l'intero controllo negativo sullo smistatore di celle per impostare le porte di citometria del flusso per isolare le popolazioni cellulari appropriate per l'ordinamento a singola cella. Tracciate l'antigene PE contro l'antigene APC e impostate il gate R8 come un quadrante antigene PE-positivo e APC-positivo con un basso numero di eventi nel doppio gate positivo.
Quindi, ordinare il singolo CD19-positivo CD27-positivo antigene PE-positivo, antigene APC-positive cellule in singoli pozzi di un Master Mix preparato 96 piastra di pozzo. Alla fine del tipo, coprire la piastra con cuscinetti a nastro in alluminio e centrifugare le celle per un minuto a 400 volte g prima di meno 80 gradi di conservazione. Per eseguire una reazione di trascrittasi inversa, scongelare le cellule B ordinate sul ghiaccio per due minuti prima di ruotare la piastra per due minuti a 3300 volte g per tirare il contenuto del pozzo nella parte inferiore della piastra prima dell'apertura.
Dopo aver trattato le cellule con un enzima appropriato Master Mix, aggiungere 2,5 microlitri di DNA gratuito come modello per ogni reazione PCR e aggiungere primer a una concentrazione finale di 1 micromolare ad ogni reazione. Quindi, aggiungere una concentrazione 2X di tampone di polimerasi 10X ad ogni pozzo per portare il volume finale a 25 microlitri per reazione. Ed eseguire le reazioni PCR a catena pesante e leggera ciascuna per 50 cicli.
Alla fine delle reazioni, eseguire i campioni su gel di agarosio all'1% per visualizzare i colpi di amplificazione positivi. Isolare le reazioni a catena pesanti e leggere accoppiate dalla stessa cella tramite l'estrazione del gel. Determinare la concentrazione del frammento di DNA in base alla densità ottica a 60 per calcoli accurati della miscela di liga.
Combina i frammenti di catena pesanti e leggeri recuperati con un frammento di linker e la spina dorsale del vettore di espressione utilizzando una reazione di legatura a quattro frammenti secondo le istruzioni del produttore. E trasformare le reazioni di legatura in batteri chimicamente competenti secondo le istruzioni del produttore. Una volta placcato su piastre antibiotiche, aggiungere quattro millilitri di mezzo di crescita con antibiotici alla coltura di trasformazione rimanente per l'incubazione durante la notte a 37 gradi Celsius a 250 rotazioni al minuto.
La mattina seguente, preparare un DNA miniprep dalle colture di mix di legatura durante la notte secondo le istruzioni del produttore e determinare la concentrazione di DNA plasmide risultante. Per confermare la specificità dell'antigene degli anticorpi isolati, trasfetto 10 microgrammi del DNA del miniprep con reagente di base lipidico cationico in una sospensione di 10 millilitri di 293 cellule. Incubare la coltura cellulare da tre a quattro giorni a 37 gradi Celsius e 8% di anidride carbonica e 125 rotazioni al minuto.
Al termine dell'incubazione, centrifugare la coltura per 10 minuti a 1000 volte g e recuperare il mezzo chiarificato. Misurare la concentrazione di IgG nel supernatante per affinità con la proteina A e testare ogni anticorpo nel supernatante a una concentrazione di 25 microgrammi per millilitro da ELISA rispetto ai singoli peptidi utilizzati per il tipo secondo i protocolli ELISA standard. Quindi, confermare i colpi positivi dello schermo con un ELISA aggiuntivo utilizzando diluizioni del supernatante IgG per generare una curva di concentrazione a partire da 20 microlitri per millilitro e tracciando contro la densità ottica per ogni antigene mostrando reattività allo schermo iniziale ELISA.
Per isolare anticorpi specifici dell'antigene dai donatori umani, è possibile escogitare una serie di porte di citometria per isolare le cellule B della memoria bersaglio. I linfociti sono isolati in base alle loro dimensioni cellulari e granularità, usando la dispersione avanti e laterale. A seguito dell'esclusione di doppietti e cellule morte, i marcatori fenotipico consentono la segregazione delle cellule B positive ai CD19 E delle cellule B della memoria CD27 positive di IgG.
La prima lettura della clonazione a singola cella è una conferma dell'amplificazione delle rispettive catene variabili pesanti e leggere. Qui, un esempio di amplificazione molto efficiente da 24 singole celle con un recupero accoppiato al 42% dopo la applicazione della PCR. A seguito della clonazione IgG, il vettore di espressione IgG viene traspected in cellule renali embrionali umane 293.
Gli anticorpi recuperati vengono schermati contro il pannello originale dei peptidi Tau segnati per la reattività da ELISA. Ulteriori conferme vengono quindi completate utilizzando una curva di concentrazione degli stessi campioni di anticorpi ricombinanti contro i peptidi identificati nella schermata iniziale. Per ogni colpo positivo, un singolo clone plasmide può essere isolato dalla piscina trasformata e riconfermato con lo stesso metodo ELISA.
L'obiettivo è amplificare le sequenze da singole cellule, quindi la cosa più importante da ricordare è che qualsiasi contaminazione verrà amplificata durante la parte PCR di questa procedura. Questa procedura produce anticorpi ricombinanti umani intatti, che consentono la purificazione e la caratterizzazione funzionale di tutti gli anticorpi che si desidera generare.
