È un trattamento semplice che può essere applicato a qualsiasi linea di cellule staminali o protocollo di differenziazione alle cellule prime per la differenziazione. Tutto quello che si deve fare è aggiungere DMSO all'1-2% nel supporto di manutenzione della coltura cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di aumentare significativamente il potenziale di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in qualsiasi lignaggio di scelta adescando le cellule per la differenziazione.
Il trattamento DMSO aumenta la possibilità che le cellule si distinguano dagli iPSC derivati dal paziente, consentendo loro di essere utilizzate per la terapia di sostituzione cellulare, la modellazione delle malattie e lo screening farmacologico. Può dare origine all'inizio precoce della regolamentazione che controlla la subprolife proliferazione, la differenziazione e le specifiche durante lo sviluppo embrionale. Abbiamo dimostrato che il trattamento DMSO migliora la differenziazione in quasi 50 linee di cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte dall'uomo.
Mentre altri laboratori hanno dimostrato che è vantaggioso per le cellule staminali di altre specie, come topo e primate. Un giorno prima dell'inizio della differenziazione, aggiungere DMSO a una concentrazione dell'1 o del 2% per 24 ore nel tipico mezzo di manutenzione. 24 ore dopo il trattamento DMSO, sostituire il mezzo e procedere con il solito protocollo di differenziazione.
Far crescere le cellule secondo le indicazioni manoscritte. Quando le cellule raggiungono un'appropriata confluenza, dissociarle e preparare una singola sospensione cellulare. Contare le cellule vive con un emocitometro o un contatore automatico delle celle, utilizzando un marcatore di vitalità come trypan blue.
Al fine di ottenere l'80-90% di confluenza entro il pretrattamento DMSO 24 ore su 24, placcare le celle su una piastra rivestita a sei pozzi ad una densità da 500.000 a 1 milione di cellule per pozzo. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica. Quindi, aspirare il supporto e sostituirlo con una soluzione DMSO 1-2%..
Lasciare incubare le cellule per 24-28 ore prima della differenziazione. Se si incuba per 48 ore, sostituire il supporto dopo 24 ore con una fresca soluzione DMSO. Per ottenere la differenziazione delle impostazioni cultura 3D, far crescere e raccogliere le cellule in una sospensione cellulare.
Contare le cellule vive e placcarle in una piastra a sei elementi non rivestita e a basso attacco in mezzi a cellule staminali con inibitore ROCK. Tipicamente, le sfere di cellule staminali pluripotenti umane 3D si formeranno entro 24 ore. Consentire alle cellule di incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica.
Preparare l'1-2%DMSO in supporti a cellule staminali prerifavositi secondo le indicazioni manoscritte. Per sostituire il supporto dopo l'incubazione, inclinare la piastra a un angolo da 30 gradi a 45 gradi e consentire alle sfere cellulari di depositarsi nella parte inferiore del pozzo. Aspirare il supporto dalle celle e sospenderle delicatamente nella soluzione DMSO.
Consentire alle cellule di incubare per 24-48 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica. Pre-trattare le cellule con DMSO come descritto per le colture 2D e preparare soluzioni stock noggin e SB431542. Preparare abbastanza sostituzione del siero knockout del 10%, o KOSR, in DMEM knockout per tre o quattro giorni di cambiamento dei supporti.
Preparare i mezzi di differenziazione ectodermica aggiungendo noggin e SB431542 al DMEM ad eliminazione diretta KOSR pre-riscaldato come descritto nel manoscritto. Dopo il pretrattamento dmso, aspirare i mezzi dalle cellule e aggiungere due millilitri di mezzi di differenziazione a ciascun pozzo. Consentire alle cellule di incubare per tre o quattro giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica, sostituendo quotidianamente i media con nuovi fattori di differenziazione.
Il pretrattamento dmso comporta una diminuzione transitoria e dose-dipendente del tasso di crescita cellulare rispetto alle cellule non trattate. Questa diminuzione della proliferazione è associata a un aumento del contatto da cellula a cellula, che è particolarmente pronunciato nelle cellule trattate con DMSO al 2%. Quando le cellule sono fisse e macchiate per marcatori prototipali di ogni strato germinale, si può vedere che il pretrattamento del 2%DMSO si traduce in una maggiore proporzione di cellule a strato germinale differenziate.
Ad esempio, SOX17 è stato macchiato per visualizzare le celle endodermi. Al fine di studiare l'effetto del DMSO sulla differenziazione ai tipi di cellule progenitrici del sistema nervoso centrale, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo potrebbero essere differenziate in cellule progenitrici neurali o cellule progenitrici oligodendrociti. Rispetto alle cellule di controllo, il pretrattamento del 2%DMSO aumenta l'espressione del marcatore cellulare progenitore neurale Pax6.
Allo stesso modo, il pretrattamento aumenta la proporzione di cellule che esprimono il marcatore cellulare progenitore di oligodendrociti Olig2. Inoltre, il trattamento DMSO iniziale migliora la funzione cellulare derivata dalle cellule staminali embrionali umane a seguito di un trapianto in vivo. Quando le cellule progenitrici pancreatiche differenziate vengono trapiantate in topi immunodifesa, la loro funzionalità può essere testata in risposta a una sfida di glucosio o alla stimolazione KCl.
I miglioramenti nella funzionalità cellulare sono evidenti da due settimane a 16 settimane dopo il trapianto. La considerazione più importante da prendere in considerazione è il tempo di ciclo o raddoppio delle cellule staminali. La durata del trattamento DMSO dovrebbe essere la stessa del tempo di ciclo delle cellule.
Dopo il trattamento dmso iniziale, si può capire come la proliferazione cellulare e il ciclo cellulare sono regolati nelle cellule staminali, poiché il trattamento aiuta a promuovere l'arresto della crescita nella fase G1 del ciclo cellulare. Le cellule differenziate possono essere utilizzate per comprendere i meccanismi correlati alla malattia, per la co-ristrutturazione con altri tipi di cellule, nei saggi di tumorigenicità e nei saggi funzionali o negli studi di trapianto per determinare se le cellule differenziate possono salvare un fenotipo di malattia.
