Il saggio del doppio righello del DNA può fornire spunti meccanicistici per la traslocazione ribosoma e sondare altri spostamenti di acidi nucleici. Il nostro saggio sul doppio righello del DNA è attualmente l'unico metodo in grado di sondare oggettivamente sia i lati di entrata che di uscita dell'mRNA nei complessi ribosomici con risoluzione mono nucleotidica. Metodi simili vengono applicati anche per misurare la forza di legame del DNA e la selettività dei farmaci chemioterapici.
La dimostrazione visiva del metodo è una buona occasione per mostrare intuitivamente i vantaggi della nostra tecnica e aiutare altri ricercatori a svilupparla ulteriormente in più applicazioni. Per iniziare, fare bene un campione di plastica con una striscia di stirene forando un cubo al centro con dimensioni di quattro millimetri per tre millimetri per due millimetri. Quindi, usando epossidico, incollare un pezzo di vetro rivestito di biotina, lungo circa cinque millimetri, sulla superficie inferiore.
Aggiungere 20 microlitri di 0,25 milligrammi per soluzione acquosa di streptavidina millilitro nel pozzo del campione e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti. Quindi sciacquare bene il campione due volte con buffer TAM10. Per immobilizzare i complessi ribosomi senza antibiotici, rimuovere prima bene il tampone dal campione e aggiungere 20 microlitri di 0,1 micromolare MF-Pre o MF-Post ribosoma complesso nel pozzo del campione.
Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora, quindi risciacquare una volta con buffer TAM10. Il complesso ribosoma ora si lega con la streptavidina sulla superficie attraverso la biotina a cinque estremità primaria sull'mRNA. Per l'esperimento con antibiotici, incubare nove microlitri del complesso MF-Pre con un microlitro di quattro neomicina millimolare, 37 gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi combinare in un tubo 0,6 microlitri di 60 micromolare EFG, 0,8 microlitri di 100 GTP micromolare, 0,8 microlitri di PEP da 100 millimolare, 0,3 microlitri da 1,3 milligrammi per millilitro piruvato chinasi, 6,43 microlitri tampone TAM10 e un microlitro di cinque millimolare acido fusidico. Incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi combinare le due miscele e incubare a 37 gradi Celsius per altri cinque minuti.
Effettuare gli altri esperimenti sugli antibiotici allo stesso modo, con concentrazioni di viomicina millimolare 0,2 millimolare, 0,4 millimolare igromicina B e acido fusidico 0,25 millimolare. Per lo studio dello spostamento del telaio, ripetere l'incubazione per i complessi MFNF-Pre che coinvolgono il motivo scivoloso, U6A. Includere antibiotici di acido fusidico più neomicina.
È necessario tempo sufficiente per garantire il completamento del processo di ibridazione. Si consiglia inoltre di utilizzare il tampone TAM10 con un cloruro di sodio talpa per mantenere un sistema omosestabile. Dopo l'incubazione, rimuovere bene il tampone dal campione.
Aggiungere 20 microlitri di un filamento di DNA di sonda biotinylato micromolare e incubare a temperatura ambiente durante la notte. Al mattino, sciacquare il duplex DNA/mRNA formato una volta con buffer TAM10. Rimuovere bene il buffer dal campione.
Quindi aggiungere 20 microlitri di 0,5 milligrammi per perline magnetiche rivestite con streptavidina millilitro nel pozzo del campione e incubare a temperatura ambiente per due ore. Successivamente, inserire accuratamente il campione in un supporto e posizionarlo in una centrifuga per rimuovere le particelle magnetiche libere dalla superficie a 84 volte g per cinque minuti. Accendi il laser.
Quindi premere il pulsante di accensione. Regolare la sensibilità a 500 millivolt e attendere circa due ore per riscaldare e stabilizzare il magnetometro atomico. Per impostare il magnetometro atomico, eseguire il software di controllo dello strumento e impostare la modalità di spostamento del motore su Rumore e la posizione predefinita su zero.
Premere Blocca sul pannello frontale. Regolare la sensibilità a 200 millivolt. Regolare la corrente e la tensione del laser e trovare il picco di risonanza e il livello di segnale-rumore adeguati per la migliore risoluzione del segnale.
Premere Sweep sul pannello frontale. Assicurarsi che il rapporto ampiezza-larghezza sia superiore a 0,5 e che il valore di fase sia inferiore a cinque gradi con larghezza inferiore a 170 hertz. Collegare l'uscita di un altro amplificatore lock-in SR530 al feedback del laser per bloccarne la frequenza.
Collega il generatore di funzioni ATF20B per inserire un'onda quadrata di 500 millivolt dal picco al picco, 100 millihertz come segnale di riferimento per convertire la corrente in segnale magnetico. Quindi scollegare il generatore di funzioni. Impostare la modalità di spostamento motor su due modi e la posizione predefinita su 260 millimetri.
Controllare lo stato del regolatore di temperatura, per assicurarsi che la temperatura sia di circa 37 gradi Celsius, del sensore atomico. Controllare la stabilità dell'intero sistema due volte eseguendo direttamente il programma senza caricare campioni per misurare i segnali del portacampioni vuoto. Per magnetizzare i campioni, utilizzare delicatamente le pinzette per elevare il campione dal supporto e posizionarlo sulla fase di magnetizzazione per due minuti.
Quindi rimettere il campione nel supporto del campione e centrifugare a 335,4 volte g per 20 minuti. Rimuovere le particelle magnetiche legate aspecificamente. Quindi caricare il campione sul motore con una pinzetta.
Fate clic su Blocca (Lock) sul pannello frontale per eseguire il programma. Nel frattempo utilizzare una pinzetta per caricare un altro campione nel supporto e posizionarlo nella centrifuga. Fare la faccia laterale in vetro rivestito al centro della centrifuga e avviare la centrifugazione a 335,4 volte g per quattro minuti.
Quando il motore torna a zero, dopo circa cinque minuti, fare clic su Salva sul pannello frontale. Utilizzare con cura le pinzette per trasferire un campione dal motore al supporto della centrifuga. Applicare una forza più forte aumentando la velocità centrifuga di 100 giri/min o una dimensione del gradino simile.
Scambiare il campione con la centrifuga. Elaborare alternativamente per aumentare gradualmente la forza ogni volta. Uno spettro di forza completo si ottiene dopo 10-12 punti dati.
Al termine di tutti gli esperimenti pianificati, spegnere l'attrezzatura, procedendo nell'ordine opposto a quello in cui è stata accesa. Rimuovere i campioni dal supporto e immergerli in etanolo per la pulizia e l'uso futuro. Pulire il portacampioni con acetone in caso di contaminazione magnetica delle perline.
In questo protocollo, il complesso ribosoma è stato immobilizzato sulla superficie, attraverso l'estremità a cinque primi dell'mRNA, e ha reso sia il lato a cinque che il lato tre primi facilmente accessibili per i righelli del DNA di sonda. Quando il linker per il lato a cinque primi era più lungo di 50 timina, fu rilevato un forte segnale magnetico, che indicava una formazione riuscita di duplex DNA/mRNA. Variando il numero di nucleotidi sul DNA, la correlazione tra forza di dissociazione e lunghezza duplex è stata raggiunta rispettivamente per i lati tre primi e cinque primi.
I risultati della normale traslocazione da MF-Pre a MF-Post, in assenza di antibiotici, mostrano che il ribosoma si muoveva da tre nucleotidi verso l'estremità a tre primi su entrambi i lati. MF-Pre trasportava un vagrant fMet-tRNA e fenilalanina-tRNA rispettivamente nei siti P e A, mentre MF-Post trasportava fMet-tRNA e fenilalanina-tRNA rispettivamente nei siti E e P, con un sito A vacante. Tuttavia, quando erano presenti sia l'acido fusidico che gli antibiotici adiomicina, il ribosoma si muoveva da un solo nucleotide sul lato a cinque primi ma due nucleotidi sul lato tre primi.
Dopo aver lavato via gli antibiotici, si è verificata una normale traslocazione, come evidenziato da tre movimenti nucleotidici da entrambi i lati cinque primi e tre primi. Quando si magnetizza il campione, la superficie rivestita dovrebbe avvicinarsi e lasciare il magnete verticalmente. E rimuovere le particelle magnetiche non legate in modo specifico è molto importante per l'accuratezza e la qualità dei dati.
La nostra tecnica fornisce un'alta risoluzione e un modo generalmente applicabile per studiare lo spostamento molecolare dell'acido nucleico che è ampiamente incontrato in biologia molecolare.
