L'obiettivo generale del seguente articolo sul metodo è quello di dimostrare un protocollo utile per studiare le interazioni dell'RNA con proteine o altri fattori utilizzando pinzette ottiche accoppiate con microscopia confocale. Negli ultimi dieci anni, sono state sviluppate diverse tecniche sofisticate per studiare le proprietà delle singole macromolecole. Una di queste tecniche sono le pinzette ottiche a singola molecola.
Con le nuove pinzette ottiche assistite da fluorescenza, non solo le forze necessarie per lo spiegamento delle molecole di RNA, ma anche gli eventi di legame durante la traduzione possono essere monitorati in dettaglio. Qui ci concentriamo sulle misurazioni in cui le molecole di RNA sono allungate con e senza fattori di transazione che regolano la traduzione. Illustriamo anche come la tecnica può essere applicata per monitorare la traduzione utilizzando ribosomi etichettati.
Il protocollo sarà dimostrato da due studenti laureati del mio gruppo, Lukas Pekarek e Stefan Park. In questo video, ti guideremo attraverso la configurazione e l'esecuzione di un esperimento di pinzette ottiche. Descriviamo anche il semplice flusso di lavoro di analisi dei dati.
Il vantaggio di questa tecnica è che è semplice e robusta. Una molecola è legata tra due perline, legata al fuoco dei raggi laser, e il cambiamento e la forza allo spostamento possono essere misurati con precisione nei cosiddetti esperimenti di rampa di forza. Le strutture secondarie all'interno di un cavo si dispiegano a una certa forza a seconda dell'energia interna della molecola.
Questa transizione dinamica tra più strutture può essere ulteriormente studiata con misurazioni di forza costante. Inoltre, l'uso parallelo dell'imaging fluorescente può essere utilizzato per visualizzare gli eventi di legame in tempo reale. Un profilo di forza-distanza distinto di un cavo potrebbe variare dopo il legame di potenziali fattori di transazione che influenzano la sua stabilità.
In primo luogo, l'RNA di interesse deve essere clonato in un vettore di DNA. A monte e a valle di questa sequenza, sono necessarie parti aggiuntive, le maniglie per legare il costrutto finale DNA-RNA tra le perle. Dopo aver superato con successo la clonazione e l'amplificazione del plasmide, vengono eseguite tre diverse reazioni PCR.
Per ogni reazione PCR, mescolare i reagenti secondo la tabella uno del protocollo. Eseguire la PCR in aliquote da 50 microlitri in un appropriato termociclatore. Il primo si traduce in un DNA a doppio filamento dell'intero costrutto con il promotore T7 per la successiva trascrizione in vitro.
La seconda PCR produce le cinque maniglie principali. Mentre l'ultima reazione si traduce nelle tre maniglie principali. Sia 5 maniglie prime che 3 prime devono essere etichettate in base alle perline utilizzate.
Le tre maniglie principali sono etichettate durante la PCR utilizzando un primer inverso marcato con digossigenina e le cinque maniglie prime devono essere etichettate in un passaggio aggiuntivo attraverso la biotinilazione. La biotinilazione a tre primi delle cinque maniglie prime viene eseguita utilizzando T 40 e una polimerasi. La reazione viene eseguita per una o due ore a temperatura ambiente.
Quindi, eseguire la trascrizione in vitro utilizzando la polimerasi T7. Incubare la reazione a 37 gradi per due o quattro ore, a seconda della lunghezza dell'RNA. In un'ultima fase, le maniglie vengono ricotte con l'RNA dalla trascrizione in vitro per ottenere il costrutto finale DNA-RNA con la singola regione di interesse a filamento tra le maniglie a doppio filamento.
Per ricottura dell'ibrido RNA-DNA desiderato, mescolare le maniglie e l'RNA nel tampone di ricottura. Riscaldare, la miscela di ricottura fino a 85 gradi per 10 minuti, quindi raffreddare lentamente il campione a quattro gradi. Mescolare il campione ricotto con 1/10 di volume di tre molari acetato di sodio e tre volumi di etanolo ghiacciato e incubare meno 80 gradi per almeno un'ora.
Centrifugare i campioni a 15.000 xg per 30 minuti a quattro gradi. Scartare il surnatante e asciugare il pellet sotto vuoto. Piccole aliquote del pellet risospeso vengono congelate in azoto liquido e mantenute a meno 80 gradi fino a quando non vengono utilizzate.
Per prima cosa rimuovere la candeggina dalle siringhe e riempire un mL di acqua priva di RNasi. Aggiungere 50 microlitri di 0,5 tiosolfato di sodio molare e lavare il sistema con una barra. Fare attenzione che il sistema microfluidico non si esaurisca mai per evitare bolle d'aria nel sistema.
Quindi, scartare la soluzione rimanente di tiosolfato di sodio e sostituire le siringhe con quelle nuove. Quindi lavare di nuovo con almeno 0,5 ml di acqua priva di RNase. Per impostare il sistema ottico della macchina, mettere due gocce di olio di immersione sull'obiettivo.
Mettere la cella di flusso in posizione e aumentare l'obiettivo fino a quando il liquido tocca la cella di flusso. Quindi mettere due gocce di olio per immersione sopra la cella di flusso. Ora accendi l'unità di guida della trappola e il laser di intrappolamento.
L'obiettivo viene regolato utilizzando lo strumento Z finder delle telecamere diagnostiche della macchina. Ruotando la microvite, l'asse Z viene regolato al centro della camera tra la seconda e la terza riflessione. Dove gli anelli di rifrazione sono i più grandi.
Passare le telecamere diagnostiche alla modalità luna e ridurre il laser di intrappolamento a circa il 50%, quindi abbassare il condensatore e regolarne la posizione in modo da vedere circa 10 bande luminose. La camera di misura ha cinque canali e, prima dell'esperimento, dovrebbero essere prese in considerazione diverse possibilità di configurazione. Per un semplice esperimento di rampa di forza, perline-buffer-perline è una comoda disposizione del canale.
Per le misurazioni con il quarto composto, come i ribosomi fluorescenti o i fattori di transazione, il fattore tampone di perline-perline è una disposizione migliore, ma rende più difficile catturare le perline. Un'aliquota del costrutto ricotto viene incubata con tre microlitri di sospensione di perline AD, un microlitro inibitori della RNasi e otto microlitro del tampone di dosaggio a temperatura ambiente per 10-20 minuti. Quindi il campione viene diluito in un tampone di dosaggio da 500 microlitri e inserito nel rispettivo canale.
Per il secondo tipo di perline, 0,8 microlitri di perle di saggio vengono miscelati con un mL di tampone di saggio e somministrati nel canale corrispondente. I canali vengono aperti e lavati a bassa pressione. Ora accendi il laser di intrappolamento.
Per catturare le perline, i laser vengono spostati l'uno dall'altro e una perla AD viene catturata nella trappola uno. Successivamente lo stadio viene spostato sul canale di perline SA e una perla viene catturata nella trappola due. Per evitare di perdere le perline o di catturarne una seconda nella stessa trappola, lo stadio viene spostato sul canale buffer e tutti i canali vengono chiusi.
Nel buffer viene eseguita una calibrazione della trappola. Le perle catturate dovrebbero essere impostate come modelli visivi per le misurazioni successive. E il punteggio di somiglianza dovrebbe essere mantenuto al di sopra del 90% tra le misurazioni per garantire la comparabilità.
Infine, le perline vengono avvicinate e si può iniziare a catturare un singolo laccio. Questo viene fatto spostando le perline vicino per alcuni secondi e poi lentamente lasciare le perline di nuovo. Una formazione di cavi si traduce in un aumento della forza misurata dopo aver tirato le due perle lontano l'una dall'altra.
Il numero e la qualità dei cavi possono essere controllati trovando il plateau di sovraccarico e confrontando la traiettoria con la catena liberamente giuntata o il modello di catena simile a un verme. L'altopiano di sovraccarico dovrebbe essere compreso tra 50 e 60 piconewton per un singolo cavo. Per eseguire le misure di fluorescenza, accendere i laser confocali e il conteggio dei fotoni sull'unità e sulla pinzetta ottica.
Successivamente, accendere il laser di eccitazione della lunghezza d'onda desiderata e l'interfaccia software e impostare la potenza del laser al 5% o superiore, a seconda del fluoroforo. Ora l'imaging può essere avviato utilizzando le funzioni di immagine o kymograph del software. Per ottenere immagini ben focalizzate, assicurarsi che il piano focale del microscopio confocale e le trappole ottiche siano allineati.
A tale scopo, è possibile utilizzare l'autofluorescenza delle perle di polistirene nel canale laser blu. Muoviti su e giù con il piano focale delle trappole ottiche fino a quando l'autofluorescenza delle perline raggiunge il suo diametro più alto. In questa posizione, i segnali di fluorescenza che avvengono alla molecola legata possono essere rilevati.
Per entrambe le funzioni è importante selezionare le regioni di interesse appropriate. In tutta la composizione del buffer di misura può essere facilmente modificata spostando le perline su canali diversi o cambiando il buffer fornito nel sistema microfluidico. Per evitare il fotosbiancamento, spegnere sempre il laser di eccitazione quando non si misura.
L'output di dati grezzi dal dispositivo spesso contiene molto rumore. Pertanto, al fine di analizzare ulteriormente i dati sparsi, è necessario prima pre-elaborarli. Il primo passo è quello di abbassare il campione e filtrare i dati con il filtro Butterworth passa-basso, sono stati ottenuti buoni risultati.
Per gli esperimenti di rampa di forza, gli eventi che si dispiegano devono essere contrassegnati nelle corrispondenti regioni piegate e spiegate della prima curva di distanza possono essere montate utilizzando modelli a catena a forma di verme o a catena liberamente articolata. Per i dati di forza costante, la distanza nel tempo può essere tracciata ed è utile generare un istogramma per quantificare la conformazione predominante ad una data forza. Qui viene mostrato che i parametri del filtro sono cruciali per distinguere i diversi stati di piegatura.
Per comprendere meglio cosa si può ottenere con questa tecnica, vengono mostrati alcuni risultati rappresentativi. Ecco come appare una curva forza-distanza standard da un esperimento forza-rampa. In questo caso, abbiamo studiato l'elemento di spostamento del telaio SARS-coronavirus-2.
Abbiamo osservato lo svolgimento in più fasi intorno a 15 piconewton. Quando la direzione è invertita e le perline si avvicinano di nuovo, il cavo si ripiega a una forza leggermente inferiore. Quando abbiamo misurato lo stesso RNA in presenza della proteina antivirale ZAP del dito di zinco, è stato osservato un modello simile di dispiegamento.
Ma la struttura secondaria dell'RNA non si è ripiegata. Questo è un buon esempio per mostrare quale grande influenza può avere il legame proteico sulla cinetica dell'RNA. Osservando i dati di forza costante, la cinetica di dispiegamento può essere ulteriormente studiata.
La distanza nel tempo viene tracciata per diverse forze e l'istogramma dei diversi stati osservati viene aggiunto sulla destra. A 10 piconewton, l'RNA è completamente nello stato piegato. A 11,5 piconewton passa da uno stato all'altro, e a 13 piconewton l'RNA è permanentemente in uno stato dispiegato.
Tuttavia, quando l'elemento di spostamento del frame SARS-coronavirus-2 è stato misurato insieme a ZAP, l'RNA era completamente in uno stato dispiegato a 11 piconewton e ha persino mostrato pochissima transizione verso uno stato piegato a 10 piconewton. Ciò indica che ZAP si lega al singolo elemento di spostamento del telaio a trefoli e impedisce la formazione di una struttura secondaria. Infine, esamineremo alcuni dati delle pinzette ottiche accoppiati con la microscopia confocale.
In questo esperimento, è stato utilizzato un colorante fluorescente che etichetta gli acidi nucleici a doppio filamento, non specificamente con forza crescente. Il kymograph mostra che quando le perle vengono spostate l'una dall'altra, l'intensità della fluorescenza aumenta e scompare completamente una volta che il cavo è allungato troppo e si rompe. Nell'ultima figura sono stati aggiunti ribosomi marcati in modo fluorescente attraverso il canale quattro.
In questo esperimento è stato osservato un legame specifico del ribosoma al legame dell'RNA. Speriamo che questo video ti abbia dato un'idea delle pinzette ottiche e di cosa si può eseguire questa incredibile tecnica.
