Questo metodo è significativo perché nessun altro protocollo permette di analizzare l'RNA appena sintetizzato in una scala di tempo così breve, e consente esperimenti di inseguimento a impulsi con un impulso così breve. Questo protocollo funziona bene con l'esaurimento proteico, come il protocollo Best AID 4U. Il vantaggio principale è che lo sfondo è basso.
Ciò consente tempi di etichettatura brevi, rimuovendo quasi tutti gli RNA non teolati. Il protocollo scritto descrive anche molti tipi diversi di esperimenti che potrebbero essere eseguiti e come integrarli in questa tecnica. Per iniziare questa procedura, coltivare lievito in mezzo YMM a un OD 600 compreso tra 0,6 e 0,8.
In una cappa aspirante aggiungere un metanolo equivalente al 30-50% del volume del campione previsto in un tubo da 50 millilitri. Chiudere saldamente i tubi, etichettarli e metterli sul ghiaccio secco per raffreddare. Successivamente, etichettare due tubi millilitro per la conservazione a lungo termine dei campioni e posizionare sul ghiaccio per raffreddare.
Aggiungere perline di zirconia ai due tubi millilitro. Raffreddare almeno un millilitro di acqua per campione sul ghiaccio. Se si deve aggiungere un picco S.pombe alla coltura, posizionare un'aliquota di cellule S.pombe tiolate sul ghiaccio per scongelarsi.
Vortice l'aliquota scongelata e aggiungerla alla cultura. Quindi aggiungere 4tU alla coltura ad una concentrazione di 10 micromolare e mescolare vigorosamente. Thio-label per un periodo di tempo compreso tra 15 secondi e cinque minuti.
Prelevare campioni della coltura a intervalli regolari fino alla fine del corso di tempo. Aggiungere ogni campione a uno dei tubi di centrifuga preparati contenenti metanolo. Sigillare ogni tubo, agitare per mescolare accuratamente e posizionare sul ghiaccio secco.
Una volta prelevati tutti i campioni, metterli tutti sul ghiaccio. Assicurarsi che nessuno dei campioni si sia congelato. Se qualcuno si è congelato, scaldarli delicatamente nella mano mentre si inverte costantemente.
Centrifugare le cellule a 3.000 volte g e a quattro gradi Celsius per due minuti per pellettare le cellule. Versare il liquido e rimescolare il pellet in almeno un millilitro di acqua ghiacciata tubazione vigorosa su e giù. Trasferire la sospensione sul tubo del tappo a vite preparato e posizionare il tubo sul ghiaccio.
Centrifugare brevemente i campioni ad una velocità superiore a 13.000 volte g per ri-pellettare le cellule. Quindi rimetterli sul ghiaccio e rimuovere il liquido. In primo luogo, aggiungere 400 microlitri di tampone AE, 40 microlitri di SDS e 800 microlitri di fenolo a basso pH.
Resuspend con vortice per 10 secondi. Quindi lisci le cellule in un omogeneizzatore per tre raffiche di due minuti all'impostazione di potenza più bassa. Lasciare i campioni sul ghiaccio per due minuti tra gli impulsi di omogeneizzazione.
Posizionare le cellule lisci sul ghiaccio secco per cinque minuti fino a quando non si solidifica. Quindi, utilizzare un microcentrifugo per far girare le cellule a una velocità superiore a 13.000 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, eseguire l'estrazione cloroformio del fenolo e l'estrazione cloroformio come delineato nel protocollo di testo.
Aggiungere tra 1/3 e 1/2 del volume di 10 cloruro di litio molare e mescolare per far precipitare l'RNA. Centrifuga a una velocità superiore a 13.000 volte g per cinque minuti. Rimuovere il fluido e ri-ruotare brevemente il campione per rimuovere le feccia.
Quindi, lavare il pellet con da 300 a 500 microlitri di 70%etanolo. Centrifugare brevemente il pellet lavato e rimuovere l'etanolo rimanente. Sciogliere di nuovo il pellet di RNA in 90 microlitri di TE a un pH 7.0 riscaldandosi a 65 gradi Celsius mentre si trema.
Dopo aver controllato la solubilizzazione completa dell'RNA, trasferire la sospensione in un tubo da 0,2 millilitri. Per iniziare, biotinilato aggiungendo 10 microlitri di soluzione di HPDP-biotina all'RNA e mescolare accuratamente. Incubare al buio a 65 gradi Celsius per 15-30 minuti.
Quindi, preparare un piccolo volume di resina, colonna di esclusione delle dimensioni per escludere la biotina non incorporata. Rimuovere l'etichetta inferiore della colonna, allentare il cappuccio e posizionare la colonna in un tubo di centrifuga a due millilitri. Centrifuga a 1.500 volte g per un minuto per stanare il tampone e scartare il flusso.
Quindi aggiungere delicatamente 0,3 millilitri di TE nella parte superiore della colonna e ruotare di nuovo usando le stesse condizioni. Trasferire la colonna lavata in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Al termine dell'incubazione del campione, aggiungere il campione nella parte superiore della colonna.
Centrifuga a 1.500 volte g per due minuti, lasciando il campione di RNA biotinilato nella parte inferiore del tubo. Scartare la colonna. E aggiungere da 1/3 a 1/2 volume di 10 cloruro di litio molare al tubo contenente il campione.
Mescolare per far precipitare di nuovo l'RNA. In primo luogo, sciogliere di nuovo l'RNA in 200 microlitri di acqua trattata con DEPC. Misurare la concentrazione di RNA e calcolare i volumi per ogni campione che darà uguali quantità di RNA per tutti i campioni.
Aggiungere questa quantità di RNA a un tubo fresco e aggiungere acqua trattata con DEPC fino a un volume totale di 200 microlitri. Quando un campione è a temperatura ambiente, aggiungere 25 microlitri di tampone NaTM 10 x, 25 microlitri di un fosfato di sodio molare e 2,5 microlitri di 10%SDS. Mescolare accuratamente e centrifugare delicatamente a circa 100 volte g per meno di 30 secondi.
Preparare due millilitri di tampone di perline per ogni campione con un tampone natm x, 0,1 fosfato di sodio molare e 0,1%SDS. Aggiungere 50 microlitri di perline di streptavidina a un tubo a bassa ritenzione da 1,5 millilitri. Posizionare il tubo sul rack magnetico e attendere che le perline si sistemino.
Quindi, rimuovere il fluido per aspirazione. Per lavare le perline, aggiungere 200 millilitri di tampone di perline e vortice fino a quando il pellet di perline non viene completamente rimorsinato. Centrifugare il tubo a circa 100 volte g per un massimo di cinque secondi.
Posizionare il tubo nel rack magnetico per consentire alle perline di essere catturate dal magnete. Rimuovere il fluido per aspirazione se ci sono un piccolo numero di campioni. Versare il fluido e quindi aspirare se ci sono molti campioni.
Blocco con 200 microlitri di tampone di perline, 10 microlitri di glicogeno e 2,5 microlitri di tRNA. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti ruotando fine su fine a velocità moderata. Successivamente, rimuovere il fluido e lavarlo di nuovo, come indicato nel protocollo di testo.
Riprestare le perline nel campione e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti durante la rotazione. Durante questa incubazione, preparare un tubo fresco da 1,5 millilitri per ogni campione. Aggiungere 1/10 volume di tre acetati molari di sodio a pH 5.3 e 20 microgrammi di glicogeno.
Centrifuga a circa 100 volte g per tre secondi. Rimuovere l'RNA non associato dalle perline e lavarlo come indicato nel protocollo di testo. Per eludere l'RNA, aggiungere 50 microlitri di 0,7 beta mercaptoetanolo molare appena preparato alle perline.
Dopo il vortice e la centrifugazione, posizionare il liquame nel rack magnetico. Pipettare l'RNA contenente la soluzione nei tubi di centrifuga da 1,5 millilitri preparati. Elute ancora una volta come descritto in precedenza.
Quindi, riposizionare il campione nel rack magnetico per rimuovere le perline residue dall'RNA eluitato e trasferire il fluido in un tubo di centrifuga fresco e a basso legame da 0,5 millilitri. Mescolare il campione. E poi aggiungere 2,5 volumi di etanolo per far precipitare l'nsRNA.
Dopo la miscelazione e l'incubazione, centrifugare ad una velocità di almeno 13.000 volte g e a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Le rese tipiche per lo snRNA recuperato utilizzando questo protocollo sono mostrate qui. Si noti che il recupero dell'RNA al punto zero del tempo è una porzione molto piccola di quella recuperata da punti di tempo più lunghi con solo 0,3 microgrammi di RNA recuperati da circa 30 miliardi di cellule.
Dopo soli 30 secondi di etichettatura, tuttavia, oltre il doppio dell'RNA viene raccolto dallo stesso numero di cellule. Nella traccia del bioanalyzer, i nostri precursori dell'RNA possono essere visti come un picco vicino a 1.000 nucleotidi e un farseto di picchi a 1.700 a 1.800 nucleotidi. L'abbondanza di questi intermedi aumenta man mano che la tiolazione continua.
La tiolazione viene quindi eseguita con campioni prelevati a intervalli di 15 secondi dall'inizio dell'etichettatura tio e viene monitorata l'elaborazione della trascrizione dell'RNA ACT1. Come si può vedere pre-mRNA e lariat vengono generati anche dopo soli 15 secondi di etichettatura. Dopo circa 45 secondi a un minuto, la quantità di lariat e pre-mRNA raggiunge l'equilibrio con la stessa quantità di queste specie di RNA create dalla trascrizione che vengono elaborate mediante splicing.
I passaggi più difficili sono quelli che coinvolgono le perline, il lavaggio e il blocco. Fai attenzione a non perdere le perline o a lasciarle asciugare. Una volta purificato l'RNA appena sintetizzato, è possibile utilizzare qualsiasi procedura di analisi dell'RNA tradizionale.
Si consiglia di eseguire l'RNA su un bioanalizzatore o simili. Successivamente, normalmente usiamo QPCR e RNA-Seq per analizzare l'RNA. Questo metodo si dimostrò ideale per analizzare la cinetica dell'elaborazione dell'RNA.
I passaggi più pericolosi sono quelli che utilizzano fenolo e cloroformio nell'estrazione dell'RNA. Ogni volta che usi queste sostanze chimiche in un contenitore non sigillato, fallo in un cappuccio dei fumi e indossa indumenti protettivi appropriati, un camice da laboratorio e guanti. Prestare particolare attenzione al fatto che non ci siano perline di zirconia nel filo del tubo del tappo a vite, in quanto ciò porterà a una perdita.
