La generazione di sferoidi epatici umani che utilizzano fonti autologhe può contribuire a varie aree di ricerca come tossicologia, cancro e scoperta di farmaci. Il principale vantaggio di questa tecnica è quello di utilizzare epatociti umani derivati da BDPC per ingegnerizzare sferoidi epatici umani, aggirando la carenza di epatociti umani primari o PHH. Gli sferoidi umani autologhi possono essere estesi alla medicina e alla terapia rigenerativa, specialmente nei pazienti con insufficienza epatica acuta.
A dimostrare la procedura sarà la dott.ssa Anne-Katherin Schott, responsabile del progetto nel mio laboratorio. Iniziare preparando 500 millilitri di epatoblasto KnockOut siero sostitutivo dimetil solfossido o KSR DMSO mezzo e mezzo di maturazione degli epatociti. Aliquotare il terreno di partenza e aggiungere il fattore di crescita degli epatociti freschi o HGF e l'oncostatina M o OCM a concentrazioni finali di 10 o 20 nanogrammi per millilitro per ogni cambiamento del substrato.
Trasferire tre volte 10 alle quinte cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue o cellule BD-PSC in una piastra a quattro pozzetti rivestita di biolaminina e incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque giorni. Per supportare la differenziazione endodermica, coltivare le cellule per cinque giorni in mezzo di epatoblasto KSR DMSO e cambiare il terreno ogni 48 ore. Il quinto giorno, aggiungere il terreno di maturazione degli epatociti e coltivare le cellule per altri sette a 10 giorni nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, assicurando il cambio del terreno ogni 48 ore.
Contare le celle utilizzando una camera di conteggio e centrifugare la sospensione cellulare dedifferenziata BD a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le cellule dedifferenziate BD nel mezzo KSR DMSO a due volte 10 delle sei cellule per millilitro di concentrazione. Dopo aver assicurato la sospensione a cella singola, rimuovere eventuali detriti aggiuntivi facendo passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri.
Ancora una volta, contare le celle usando una camera di conteggio e preparare un volume sufficiente di ogni densità di semina cellulare per erogare il volume richiesto per pozzetto. Preparare un gradiente con semina superiore di un milione di celle a una bassa densità di semina di 4.000 celle. Quindi, erogare 100 microlitri di mezzo KSR DMSO in piastre di attacco basso a 96 pozzetti e aggiungere 100 microlitri di diluizione della semina cellulare.
Incubare la piastra di attacco bassa per cinque giorni. Cambiare il 50% del terreno il terzo o quarto giorno dopo la semina quando gli sferoidi sono sufficientemente compatti. Il quinto giorno, cambiare il terreno di maturazione in mezzo di maturazione degli epatociti e coltivare le cellule in esso contenute per altri sette a 10 giorni, cambiando il terreno ogni 48 ore.
Dopo aver coltivato le cellule per 4, 8, 15 e 24 giorni utilizzando il metodo di differenziazione descritto in precedenza, rimuovere il terreno. Incubare le cellule con fissativi preriscaldati contenenti il 4% di paraformaldeide in PBS per 10 minuti. Quindi, scartare il fissativo e lavare le cellule con PBS due volte per cinque minuti ciascuna.
Aggiungere immediatamente la soluzione Triton X-100 allo 0,1% e permeabilizzare le cellule per cinque minuti prima di due lavaggi di PBS. Aggiungere una soluzione bloccante a base di PBS e albumina sierica bovina al 5% o BSA prima di posizionare le cellule su una piastra a bilanciere per un'ora a temperatura ambiente. Diluire gli anticorpi primari nel tampone di diluizione 1% BSA PBS e aggiungere 50 microlitri di diluizione anticorpale per pozzetto.
Scartare la soluzione anticorpale dopo un'ora di incubazione a temperatura ambiente e somministrare tre lavaggi di cinque minuti ciascuno utilizzando PBS. Aggiungere 50 microlitri di anticorpi secondari diluiti in tampone di diluizione in ciascun pozzetto e incubare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le celle tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna, montare i vetrini con supporti di montaggio contenenti DAPI per l'analisi microscopica.
Scartare con attenzione i terreni di coltura senza toccare gli sferoidi e aggiungere PBS appena preparato con la soluzione Triton X-100 allo 0,1% e incubare per cinque minuti per permeabilizzare le cellule. Lavare gli sferoidi due volte con il mezzo pipettando lentamente il mezzo. Quindi, incubare gli sferoidi con 50 microlitri di anticorpi primari per un'ora.
Una volta fatto, rimuovere con attenzione la soluzione anticorpale in eccesso e dare tre lavaggi di mezzo. Preparare gli anticorpi secondari corrispondenti come IgG Cy3 anti-topo di capra, IgG 488 anti-topo di capra e IgG Texas Red anti-pollo di coniglio in PBS con 1% BSA e aggiungere 50 microlitri di diluizione anticorpale per pozzetto prima di 20 minuti di incubazione nell'incubatore di anidride carbonica. Ancora una volta, lavare tre volte con il mezzo prima di 30 minuti di incubazione nell'incubatore.
Accendere la sorgente luminosa a fluorescenza 10 minuti prima dell'uso. Accendere il computer e aprire il software di imaging. Utilizzare l'obiettivo di ingrandimento 4X facendo clic sul pulsante 4X nella barra degli strumenti per selezionare la barra di scala corretta.
Quindi posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla piastra centrale del palcoscenico. Accendere la sorgente luminosa a LED, utilizzare il filtro a campo luminoso e posizionare la piastra nel pozzetto di interesse utilizzando la manopola di regolazione dello stadio dell'asse XY. Passare al percorso della luce della fotocamera e fare clic sul pulsante live nel software di imaging per visualizzare l'immagine sullo schermo.
Assicurarsi che lo sferoide sia centrato utilizzando le manopole dell'asse XY e mettere a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco grossolana o fine. Quindi, scegli il metodo di osservazione del campo luminoso nella barra degli strumenti, imposta le impostazioni di esposizione su automatico e fai clic sul pulsante dell'istantanea nel pannello di controllo della fotocamera per scattare una foto. Quindi salvare l'immagine come file vsi utilizzando il nome appropriato nella cartella di interesse.
Posizionare la piastra di schermatura della luce ambientale per spegnere la luce LED e cambiare il filtro per l'eccitazione B. Quindi scegli il metodo di osservazione 488. Aprire l'otturatore, scattare una foto facendo clic sul pulsante snapshot e chiudere l'otturatore e salvare il file come vsi.
Ripetere il processo con un filtro per l'eccitazione G per reiterare il processo per ogni pozzo di interesse. I cambiamenti morfologici durante il processo di differenziazione epatica hanno mostrato che le BD-PSC si sono differenziate in epatociti attraverso tre fasi. Il primo stadio rappresentava la differenziazione in cellule endodermiche.
La seconda differenziazione in cellule progenitrici epatiche presenta una tipica morfologia poligonale. E il terzo, la maturazione agli epatociti. L'analisi di immunofluorescenza ha mostrato la forte espressione di marcatori progenitori epatici umani dell'endoderma come l'alfa fetoproteina o APF e la transtiretina o TTR nelle cellule al primo stadio del processo di differenziazione epatica al giorno da L4 a L8.
Tuttavia, la loro espressione è diminuita al giorno L15. L'espressione di albumina o ALB e fattore nucleare quattro alfa o HNF4 alfa degli epatociti è apparsa per la prima volta a L4, è aumentata durante il tempo di differenziazione da L4 a L15 e ha raggiunto un'espressione forte e stabile durante il periodo di maturazione da L15 a L24. L'aggregazione spontanea delle cellule è stata osservata in piastre a basso attacco contenenti l'induzione degli epatociti o la formazione di sferoidi avviati dal mezzo di maturazione.
È stata osservata una correlazione coerente tra lo sferoide steroideo e il numero variabile di cellule. Gli sferoidi formati e differenziati a L14 e vivi colorati con anticorpi hanno rivelato la potenziale attività funzionale epatica degli sferoidi derivati da BD-PSC. La preparazione delle celle mononucleate per la riprogrammazione è il passo più importante in questa procedura.
La generazione di sferoidi epatici umani è il primo passo per creare organoidi in vitro versione semplificata dell'organo in 3D con micro anatomia simile a quella in vivo. Gli organoidi creati in laboratorio vengono utilizzati per studiare l'organogenesi, lo sviluppo della malattia e i nutrienti.
