Qui presentiamo un protocollo chirurgico per conigli con l'obiettivo di valutare i materiali di sostituzione ossea in termini di capacità di rigenerazione ossea. Il principio di base di questo modello calvariale di coniglio è quello di far crescere il nuovo tessuto osseo verticalmente sopra la parte corticale del cranio. Questo modello consente la valutazione dei materiali di sostituzione ossea per la rigenerazione orale e craniofacciale delle ossa in termini di supporto alla crescita ossea e supporto alla neovascolarizzazione.
Il modello è altamente significativo per valutare la rigenerazione ossea in quanto misura la crescita ectopica di nuovo tessuto osseo sopra l'osso maturo. Rispetto ai modelli tradizionali, in cui il nuovo osso si rigenera per riempire un difetto che è stato creato artificialmente per tornare finalmente al suo livello iniziale. Utilizzando grandi cilindri fissati su teschi di coniglio, l'osteoconduzione, l'osteoinduzione, l'osteogenesi e la vascolarizzazione indotte dai materiali possono essere valutate su animali vivi o sacrificati.
A dimostrare la procedura sarà Laurin Marger, un'associazione di ricerca del nostro laboratorio, e me stesso. Dopo aver sedato gli animali, posizionare una canula endovenosa nella vena marginale dall'orecchio e tenerla chiusa fino al completamento dell'intubazione. Posizionare il coniglio nella posizione prona e mantenere la testa in estensione verticale.
Anestetizza la trachea localmente spruzzando il 10% di lidocaina. Far scorrere un tubo endotracheale di piccolo diametro nella trachea del coniglio fino a quando il flusso d'aria può essere sentito nel tubo. Questo aprirà la laringe e faciliterà l'inserimento del tubo definitivo.
Quindi, inserire una guida nel tubo per fissare la posizione del tubo nella trachea. Rimuovere il tubo di piccolo diametro e far scorrere il tubo endotracheale definitivo sulla guida. Rimuovere la guida e gonfiare il palloncino all'estremità del tubo endotracheale per sigillare e bloccare il dispositivo nella trachea.
Fentanil continuamente abbondante per indurre l'analgesia. Da due a quattro milligrammi per chilogrammo di propofolo per indurre l'anestesia e quattro millilitri per chilogrammo all'ora di acetato di suoneria per mantenere condizioni isovolumetriche. Ventilare immediatamente l'animale con il 3% di sevoflurane in ossigeno puro.
In primo luogo, posizionare il coniglio su un pad riscaldato impostato su 39 gradi Celsius sul tavolo dell'intervento chirurgico e posizionare la sonda di temperatura rettale. Radersi il cuoio capelluto. Strofinare la pelle con iodio providone al 10% per disinfettare il sito.
Quindi, drappeggiare il coniglio con un drappo chirurgico sterile e tagliare un'area di accesso del cranio. Disinfettare il sito chirurgico con iodio providone al 10% una seconda volta. Per iniziare, anestetizza localmente con un'iniezione sottocutanea di lidocaina sul cranio.
Utilizzare il bisturi per incidere attraverso la pelle lungo la linea sagittale calvariale dalle orbite alla protuberanza occipitale esterna, assicurandosi che il periosteo sia inciso. Utilizzare un ascensore periosteale per elevare delicatamente il periostio su entrambi i lati dell'incisione. Risciacquare il sito con soluzione salina sterile.
Per prima cosa, individua i media e le suture coronali sul cranio. Si noti che queste linee anatomiche formano una croce. I cilindri saranno posizionati in ciascuno dei quadranti definiti dalla croce, assicurando che il bordo del cilindro non sia sopra la sutura.
Posizionare il primo cilindro sul quadrante superiore sinistro posando il dispositivo il più piatto possibile. Fissare la posizione del cilindro con una forte pressione della mano e avvitare in una micro vite fino a quando la resistenza non viene avvertita. Assicurarsi che la testa della vite sia a filo con la linguetta del cilindro.
Fissare l'altra linguetta del cilindro allo stesso modo per fissare saldamente il cilindro al cranio. Assicurarsi che il cilindro sia fissato ermeticamente all'osso. Quindi ripetere l'intera procedura per fissare un cilindro su ciascuno degli altri tre quadranti.
Per iniziare, praticare un foro intermidollaro sotto irrigazione salina con una bava rotonda sull'osso al centro dell'area circoscritta dal cilindro. Assicurarsi che appaia un'emorragia. Successivamente, praticare altri due fori intermidollari lungo l'asse passando attraverso le due viti a linguetta ai bordi interni del cilindro.
Lungo l'ascia perpendicolare, praticare altri due fori intermidiolari ai bordi interni del cilindro. Ripetere questo processo di foratura per gli altri tre cilindri. Quindi, riempire il primo cilindro fino all'orlo con il campione di materiale.
Chiudere il cilindro montando il cappuccio. Ripetere questo processo di riempimento per gli altri tre cilindri. Chiudere la pelle sopra i cilindri con una sutura intermittente non riassorbibile e applicare una medicazione spruzzabile sulla ferita.
Successivamente, interrompere l'alimentazione di analgesia e anestesia e verificare il recupero della respirazione autonoma. Una volta che l'animale ha recuperato la respirazione autonoma, interrompere la ventilazione. Mantenere l'animale sotto ossigeno puro prima del completo risveglio.
Iniettare buprenofina cloridrato per via sottocutanea. Ripetere l'iniezione ogni sei ore per tre giorni come analgesia post chirurgica. Lasciare che l'animale si svegli completamente prima di trasferirlo nel suo solito alloggiamento con acqua e alimentazione completa.
Il modello descritto in questo video è dedicato alla valutazione dell'osteoconduzione, osteoinduzione, osteogenesi e neovascolarizzazione nei sostituti ossei. Una volta completato l'intervento chirurgico, la crescita ossea può essere monitorata in diversi punti di tempo utilizzando la tomografia ossea su animali vivi. Un'analisi aggiuntiva richiede che gli animali siano sacrificati.
Dopo l'eutanasia, i campioni vengono sesati e i cilindri vengono accuratamente rimossi. Le biopsie vengono quindi fissate con una soluzione di formaldeide al 4% in PBS. Successivamente, la microtomografia può essere usato per valutare la crescita ossea.
I campioni possono anche essere elaborati per la colorazione istologica. L'analisi istomorfometrica e le colorazioni specifiche sono quindi possibili per completare l'analisi in modo più specifico. Poiché questo protocollo è un metodo chirurgico, tutti i passaggi sono critici e devono essere seguiti correttamente.
È importante essere addestrati per esperimenti sugli animali, specialmente nella manipolazione dei conigli e nell'anestesia. Oltre ai metodi descritti, le cellule possono essere analizzate in modo più specifico usando la citometria del flusso. L'evoluzione dei materiali, la maturazione del tessuto osseo e la meccanica possono anche essere valutate usando la nano rientrazione, per esempio.
Con l'aiuto di questo modello, sono state eseguite molte valutazioni. Come ad esempio, per gabbie in titanio o ceramica, membrane GBM, fattori osteogenici, sostituti appena nati o il meccanismo di neovascolarizzazione durante il processo di rigenerazione ossea.
