Questo lavoro è stato supportato dal CIRM precoce Translational Research Award II TR2-01821, NIH / NIDCR (sovvenzioni R21 DE0177711 e RO1 DE01607), UC Discovery Grant 07-10677, AWJ e RKS hanno T32 premi (borse di formazione 5T32DE007296-14), jnz ha una borsa di studio CIRM formazione (TG2-01169).

1. Perivascolare Stem isolamento cellulare Questo è descritto in dettaglio nella adiacente &quot;purificazione delle cellule staminali umane perivascolari da tessuto adiposo bianco&quot; articolo di M. Corselli et al. 2. Scaffold Creation <ol><li> Ponteggi sono su misura per il protocollo precedentemente pubblicato da poli (lattico-co-glicolico) (PLGA, Burmingham Polymer) con rivestimento in idrossiapatite 4-6. Apatite rivestite impalcature PLGA sono fabbricati da 85/15 PLGA da solvente per colata e un processo di lisciviazione particolato. Le impalcature sono creati in una forma sferica (2-mm di diametro) per l&#39;impianto muscolo sacchetto, una forma discoidale (4 mm di diametro) per l&#39;impianto cranica, o cilindrica (4 mm di diametro, 6 mm di lunghezza) per femorale difetti segmentale. </li><li> In breve, PLGA / cloroformio soluzioni miste con saccarosio (polimero / rapporto meno di 5/95, w / w) sono fusi in uno stampo del diametro di 200-300-micron Teflon per creare su misura construct. Dopo liofilizzazione overnight, ponteggi vengono rimosse dallo stampo e Teflon immerso in ddh 2 O per sciogliere il saccarosio. Le impalcature sono disinfettati per immersione in 70% etanolo per 30 min, seguito da tre lavaggi di ddh 2 O. </li><li> Per rivestimento di apatite, un fluido corporeo simulato soluzione (SBF) viene preparata sciogliendo sequenzialmente CaCl 2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3, e K 2 HPO 4 • 3H 2 O in ddh 2 O. PH della soluzione si abbassa a 6 con l&#39;aggiunta di acido cloridrico 1M per aumentare la solubilità. Na 2 SO 4, KCl, e NaCl vengono aggiunti e il pH finale viene regolata a 6,5 (SBF 1). </li><li> Mg2 + e HCO 3 - libera SBF (SBF 2) viene preparata aggiungendo CaCl 2 e K 2 HPO 4 • 3H 2 O in ddh 2 O e si abbassa il pH a 6. KCl e NaCl vengono aggiunti e il pH finale viene regolata a 6,8. Tutte le soluzioni sono sterili filtrata attraverso un membr 0,22 micron PESAne (Nalgene). Immediatamente prima del processo di rivestimento, i ponteggi essiccati PLGA sono sottoposti a bagliore scarico plasma di argon etching (Harrick Scientific) per migliorare la bagnatura e uniformità di rivestimento. </li><li> Etched ponteggi vengono poi incubate in SBF 1 per 12 ore e cambiato Mg2 + e HCO 3 - libero SBF 2 per un&#39;altra h 12 a 37 ° C sotto leggera agitazione. Ponteggi rivestiti vengono lavati con ddh 2 O per rimuovere gli ioni in eccesso e liofilizzati prima di ulteriori studi. </li></ol> 3. Il Muscle Pouch impianto modello <ol><li> 100 pl di una sospensione PSC in PBS (tampone fosfato salino) sono delicatamente cadere sulla sferica PLGA basato impianto subito prima dell&#39;impianto. Le cellule sono state pre-etichettato mediante inserimento lentivirale luciferasi di lucciola, così da consentire dopo l&#39;impianto in vivo inseguimento. Densità cellulare è di 2,5 x 10 5 per ogni impianto. </li><li> SCID (grave immunodeficienza combinata), i topi sono utilizzati a 6 settimane di età. Gli animali sono anesthetized per inalazione isoflurano e premedicazione con buprenorfina (Bedford Labs). Dopo la preparazione Betadine standard, incisioni bilaterali negli arti posteriori sono realizzati (longitudinale e 2 mm di lunghezza). </li><li> Tasche vengono tagliati nei muscoli bicipite femorale da parallelo smussa all&#39;asse della fibra muscolare lungo. Per ciascun topo, il PLGA basata impianto con PSC viene inserito, e la fascia sovrastante il muscolo viene suturata con 5-0 Vicryl (Ethicon). </li><li> La pelle è chiusa con successivo 5-0 Vicryl in un modello sottocuticolare. Gli animali vengono trattati nel postoperatorio con buprenorfina per 48 ore e TMP / SMX (trimetoprim / sulfametossazolo; Qualitest) per 10 giorni. </li></ol> 4. Il cranica Defect impianto modello <ol><li> Dopo l&#39;anestesia isoflurano di topi SCID (12-14 settimane), i capelli sono tagliati e la pelle disinfettato con Betadine per protocollo. </li><li> A 8 mm incisione cutanea è praticata lungo la sutura sagittale della volta cranica topo. Successivamente, il CALVarial periostio viene delicatamente rimosso da Q-tip applicazione. </li><li> Successivamente, utilizzando diamantate punte trapano in un trapano ad alta velocità dentale, uno da 4 mm difetto parietale è stato creato. Il difetto è tutto spessore - tuttavia si ha cura di non danneggiare il sottostante dura mater. </li><li> La misura PLGA-based impianto con PSC trapiantati viene poi messo delicatamente nel sito del difetto. Densità cellulare è di 2,5 x 10 5 per ogni impianto. Infine, la cute viene suturata con 6-0 Vicryl. Gli animali vengono trattati nel postoperatorio con buprenorfina per 48 ore e TMP / SMX per 10 giorni. </li></ol> 5. Il difetto femorale segmentale impianto modello <ol><li> Atimici ratti (12-14 settimane di età) sono anestetizzati con isoflurano inalazione. Il femore è rimosso e preparato secondo la procedura standard con Betadine (Figura 1). </li><li> A 27-30-millimetri incisione longitudinale è realizzata sulla faccia antero-laterale del femore. Il femore è quindi esposto separando il lat vastoeralis e muscoli bicipite femorale (Figura 2). </li><li> Per massimizzare la coerenza di rigenerazione ossea, il periostio sovrastante il difetto femorale viene completamente rimosso con il segmento asportato femorale. </li><li> Una piastra di polietilene (lunghezza, 23 mm, larghezza, 4 mm, altezza, 4 mm) è posto sulla superficie antero-laterale del femore. La piastra contiene sei fori predisposti per accogliere 0,9 mm di diametro fili di Kirschner filettati (Zimmer). Prendendo la piastra come modello, sei fili di Kirschner filettati sono perforati attraverso la piastra ed entrambe le corticali (Figura 3). </li><li> Successivamente, con una lama piccola sega oscillante (Stryker, MI), a 6 mm mid-diafisario difetto è stato creato. Difetti segmentali vengono poi trattati con l&#39;inserimento di impianti PLGA base che sono stati carica di celle come da protocollo (Figura 4). </li><li> Il muscolo e la fascia sovrastante sono chiusi con 4-0 punti di sutura riassorbibili Vicryl per fissare l&#39;impianto in posizione, e la pelle viene suturata. </li&gt; </ol> 6. Valutazioni in vivo <ol><li> Valutazioni radiografiche sono eseguite in maniera longitudinale sia XR alta risoluzione e ad alta risoluzione μCT (micro tomografia computerizzata) analisi. Per l&#39;analisi μCT (Skyscan 1172F), le immagini sono state scansionate ad una risoluzione di 19,73 micron (100 kV e 100 mA sorgente di radiazione, utilizzando un filtro in alluminio da 0,5 mm). Le immagini sono analizzate utilizzando DataViewer, Recon, CTAN e software CTVol. </li><li> Immagini bioluminescenza è anche fatto in modo seriale per valutare l&#39;attecchimento delle cellule, vitalità, proliferazione ed escludere la migrazione dal sito dell&#39;impianto. Immagini bioluminescenza è effettuato con un dispositivo di IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Uscite di luce vengono quantificati utilizzando il software Living Image (Xenogen). Emissione luminosa complessiva è registrata in fotoni / secondo / cm ² / steradiante. </li><li> L&#39;analisi istologica e istomorfometrica viene eseguito post mortem. Macchie di routine impiegate includono Masson tricromica, blu di anilina, pentachrome, e Picrosirius rosso. L&#39;analisi istomorfometrica viene eseguita facilmente con uno blu anilina o macchie pentachrome, in cui appare osteoide blu scuro e giallo, rispettivamente. Pixel per campo di alta potenza sono calcolati utilizzando lo strumento bacchetta magica in Adobe Photoshop. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Poiché entrambi i difetti cranica e femorale sono critiche imprese, non significativa la guarigione dovrebbe essere previsto senza trattamento con fattori di crescita o cellule staminali esogeni. In termini di manovre chirurgiche, la dissezione sacca muscolare dovrebbe essere lungo i piani fasciali e quindi sanguinamento minimo si dovrebbero incontrare. Anche se il modello sacca muscolare viene eseguita bilateralmente, il mouse deve essere a piedi con facilità il giorno postoperatorio 1. Per il difetto cranico, emorragia si incontra, ma può essere intrisa di una Q-tip. Prestare estrema attenzione a non ferire la dura sottostante dura - perché questo potrebbe interferirecon la guarigione normale. Per il modello FSD, si ha cura di non danneggiare i vasi sanguigni più importanti in modo da non provocare un sanguinamento eccessivo o il nervo femorale per evitare danni neurologici. Fili di Kirschner sono perforati con una leggera pressione in modo da non danneggiare l&#39;osso corticale nel processo. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" /> Figura 1. Preparazione preoperatoria per difetto di femore (FSD) nei ratti atimici. Ratti maschi (12-14 settimane di età) sono anestetizzati con isoflurano inalazione. Il femore è rimosso e preparata secondo la procedura standard con Betadine. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" /> Figura 2. L&#39;esposizione chirurgica per femorale segmentale Defect (FSD) creazione. A 27-30 millimetri incisione longitudinale è realizzata sulla faccia antero-laterale del femore. L&#39;aspetto laterale della diafisi femorale è quindi esposto separando il vasto lateralebicipite femorale e muscoli. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" /> Figura 3. Di fissaggio per femorale segmentale Defect (FSD) creazione. Una piastra di polietilene (lunghezza, 23 mm, larghezza, 4 mm, altezza, 4 mm) è posto sulla superficie antero-laterale del femore. La piastra contiene sei fori predisposti per accogliere 0,9 mm di diametro fili di Kirschner filettati. Prendendo la piastra come modello, sei fili di Kirschner filettati sono perforati attraverso la piastra ed entrambe le corticali. Successivamente, da 6 mm mid-diafisario difetto viene creato. Una volta che questo viene eseguita una misura scaffold è inserito direttamente che si adatta esattamente sito del difetto (non mostrato). <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" /> Figura 4. Esempio di difetto cranico post-operatorio. A mm 4, difetto circolare cranica viene creato nel parietale destro nei topi atimici. Creata l&#39;immagine qui è un sito del difetto impiantati conPSC a 8 settimane post-operatorie. Si noti la presenza di nuovo tessuto osseo all&#39;interno del sito del difetto.

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KT, BP, e CS sono inventori perivascolari di cellule staminali relativi brevetti depositati presso la UCLA. Drs. KT, e CS sono i fondatori del scarless Laboratories Inc., che sottolicenze perivascolari cellule staminali brevetti relativi al Regents UC. Dr. Chia Soo è anche un ufficiale di scarless Laboratories, Inc.

L&#39;isolamento di PSC è ben descritto altrove 1-3, compresa una pubblicazione JOVE separatamente presentato specificatamente legati protocolli di isolamento PSC e metodi. Lo scopo specifico di questo articolo è quello di descrivere e dimostrare 3 protocolli per PSC in applicazione vivo per la formazione dell&#39;osso / rigenerazione. La SCID sacchetto muscolare del mouse è un modello comunemente descritto per la formazione ectopica di osso umano 7. Notevoli differenze esistono tra ectopiche e ortotopico (difetto) i modelli per l&#39;osso, compresa l&#39;interazione con l&#39;host paracrino ossee 8 così come l&#39;abbondanza di osteogeniche fattori di segnalazione presenti nel microambiente difetto scheletrico. Due difetti sono presentati qui, un defect8 cranica e femorale difetto di 4. Entrambe sono ben documentati per essere critici imprese (vale a dire non guarire da soli). Interessanti differenze esistono tra i difetti cranica e femorale. In primo luogo, lacell: interazione cellulare tra PSC xenotrapiantati e cellule endogene è molto diversa. In termini di un difetto cranica, PSC interagire con il mater sottostante dura (lo strato più esterno delle meningi), nonché quelle osteoblasti e cellule periostali circoscrivono sito del difetto. È importante sottolineare che l&#39;interazione tra cellule impiantate e osteoblasti circostanti 8, o cellule impiantate e sottostante dura madre (Levi et al., In stampa) sono critici per cellule staminali normali mediata osteogenesi procedere. In termini di difetto femorale segmentale (FSD), PSC xenotrapiantati sono esposti a una cella diversa ambiente e citochine. Ad esempio, il sito FSD è composto delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo e di accompagnamento, così come la endosteum, periostio e delle ossa lunghe osteoblasti. Teoricamente, ogni cella ha la sua propria reazione al danno, e ognuno può avere l&#39;interazione fra cellule con xenotrapianti PSC. Altre differenze esistano tra cranicae difetti femorali. Le ossa cranica inizialmente formare attraverso ossificazione intramembranosa, mentre le ossa lunghe formano attraverso un intermedio cartilagine (encondrale). Inoltre, il processo riparativo post-infortunio anche imita queste origini dello sviluppo. Post-FSD, formazione del callo osseo la cartilagine si osserva, considerando che non intermedia cartilagine è formata all&#39;interno di un difetto osseo parietale. Infine, l&#39;origine embrionale del cranio può differire da quella delle ossa lunghe. La maggior parte del cranio (comprese cellule perivascolari - periciti - della regione intera testa) è derivato dalla cresta neurale (mesectoderm), mentre lo scheletro appendicolare è di derivazione mesoderma parassiale 9. Tutte queste differenze possono portare a differenze significative in termini di PSC-mediata riparazione ossea. L&#39;uso di PSC ha diversi vantaggi rispetto ai tradizionali cellule stromali derivate da tessuto adiposo (CSA). PSC non richiedono la cultura e sono una popolazione di cellule purificate WHIch non include altre cellule stromali che non partecipano - e può anche regolano negativamente - differenziazione osteogenico, come le cellule endoteliali 10. Al contrario, per esempio, analisi clonali di ASC mostrano che solo una sottopopolazione sono capaci di subire differenziazione osteogenico in vitro 11. In definitiva, scheletriche sforzi di ingegneria tissutale probabilmente integrare una cella osteocompetent staminali (come PSC) con fattori di crescita esogeni e uno scaffold osteoconduttivo (come HA-PLGA usato nei presenti metodi) per guarire meglio difetti scheletrici.

use of human perivascular stem cells for bone regeneration

Cellule staminali perivascolari (PSC) può essere isolato in numero sufficiente da diversi tessuti a fini di 1-3 scheletrico ingegneria dei tessuti. PSC sono una popolazione FACS-ordinata di &#39;periciti&#39; (CD146 + CD34-CD45-) e &#39;cellule avventiziale &quot;(CD146-CD34 + CD45-), ciascuno dei quali abbiamo già riferito di avere proprietà delle cellule staminali mesenchimali. PSC, come MSC, sono in grado di subire differenziazione osteogenico, nonché secernono pro-osteogenico 1,2 citochine. Nel presente Protocollo, dimostriamo la osteogenicity del PSC in diversi modelli animali tra cui un impianto muscolare sacchetto in SCID (immunodeficienza combinata grave) topi SCID, una difetto del mouse cranica e un difetto femorale segmentale (FSD) nei ratti atimici. Il muscolo della coscia modello sacchetto viene utilizzato per valutare la formazione ectopica dell&#39;osso. Difetti calvaria sono centrate con l&#39;osso parietale e sono ordinariamente 4 mm di diametro (criticamente imprese) 8. FSD sono bicorticale e sono stabilizzate conuna barra di polietilene e K-fili 4. La FSD è descritto anche un difetto dimensione critica, che non influisce significativamente guarire da 4 stessa. Al contrario, se le cellule staminali o fattori di crescita vengono aggiunti al sito del difetto, rigenerazione ossea significativo può essere apprezzato. L&#39;obiettivo generale di xenotrapianto PSC è quello di dimostrare la capacità osteogenico di questo tipo di cellule in modelli ossee sia ectopiche e ortotopico di rigenerazione.

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Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Le cellule staminali perivascolari (PSC) sono una nuova classe di cellule staminali per la rigenerazione tissutale scheletrico simili alle cellule staminali mesenchimali (MSC). CSP possono essere isolati mediante FACS (fluorescenza selezione cellulare attivata) da tessuto adiposo prelevati durante le normali procedure di liposuzione, poi combinato con un osteoinduttiva impalcatura per ottenere la formazione ossea<em&gt; In vivo</em&gt;.

L&#39;uso di cellule staminali per la rigenerazione ossea perivascolari

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

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20.3K Views.  School of Dentistry, UCLA. Le cellule staminali perivascolari (PSC) sono una nuova classe di cellule staminali per la rigenerazione tissutale scheletrico simili alle cellule staminali mesenchimali (MSC). CSP possono essere isolati mediante FACS (fluorescenza selezione cellulare attivata) da tessuto adiposo prelevati durante le normali procedure di liposuzione, poi combinato con un osteoinduttiva impalcatura per ottenere la formazione ossea In vivo.

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

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Bioingegneria

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Assorbimento di nuove nanoparticelle rivestite con lipidi contenenti Falcarindiol di cellule staminali mesenchimali umane

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Modellazione della geometria delle colonie di cellule staminali embrionali umane su substrati conformi per controllare la meccanica a livello di tessuto

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Un metodo di coltura per mantenere le cellule staminali ematopoietiche umane quiescenti

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali gengivali umane primarie utilizzando Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...