Name: single-cell photoconversion in living intact zebrafish
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
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Grazie a Bernard Kulemaka e membri del lab Smith per loro utili commenti e guida di reagente, Sam Connell e Brent Redford di 3i per mettere in campo imaging domande e Deborah Bang, Karen Heed e Kay Stewart per la cura di zebrafish. Questo lavoro è stato supportato dall'Università di Notre Dame, l'Elizabeth e Michael Gallagher Family, la Fondazione Alfred P. Sloan, Centro Zebrafish ricerca presso l'Università di Notre e centro di cellule staminali e medicina rigenerativa presso l'Università di Notre Dame. Tutti gli studi sugli animali sono stati fatti in conformità con la University of Notre Dame IACUC al Dr. Cody Smith.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Università di Notre Dame istituzionali Animal Care e Comitato di uso.
1. preparazione del campione di Zebrafish
<ol><li>Posizionare un maschio adulto e un adulto femmina Tg (convertibile della proteina) in una camera di accoppiamento per le procedure standard13. In questo manoscritto, utilizzare Tg(sox10:eos) pesce9 a causa di accesso ma altre linee transgeniche con fotoconvertibile della proteina può essere ugualmente usato. Impostare più di una camera nel caso in cui il pesce non posare. Consentire il pesce a rimanere nella camera durante la notte.</li>
	<li>La mattina successiva, raccogliere le uova in piastre Petri da 100 mm. Consentire uova di maturare alla post-fecondazione 24h (hpf) prima proiezione.</li>
	<li>Se gli animali di cui sopra erano eterozigoti per il transgene, schermo 24 hpf piatti per Tg(sox10:eos) + embrioni con un 488 nm sorgente e GFP filtrare i set su un microscopio per dissezione. Isolare Tg(sox10:eos) + embrioni e permettono di maturare a 48 hpf.</li>
	<li>Dechorionate embrioni manualmente con un ago o una pinzetta.</li>
	<li>Preparare e microonde 5 mL di soluzione di agarosio di punto basso punto di fusione dello 0,8%.<ol>
<li>Una volta fredde al tatto dell'agarosi, posto 3-4 anestetizzati Tg (sox10:eos) + 48 pesce hpf al centro di un coprioggetto in vetro-10 mm inferiore di Petri.</li>
		<li>Aggiungere sufficiente dell'agarosi per coprire la superficie del vetrino coprioggetti, circa 1 mL. Utilizzare un ago sonda per disporre il pesce sui loro lati. Consentire l'agarosio a solidificare per garantire il montaggio degli animali. Può essere necessario continuamente ri-organizzare il danio zebrato, fino a quando l'agar solidifica14. Solidificazione dura circa 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'agarosio è solidificato per 2 min, aggiungere lentamente il mezzo di embrione contenente 0,02% acido aminobenzoic estere (tricaina) a piatto fino a quando la superficie inferiore dell'agar e il piatto è sommerso. Questo dovrebbe essere circa 3mL.</li>
</ol>2. microscopio montaggio e pre-conversione Imaging
<ol><li>Confocale software Open e selezionare le finestre di acquisizione e messa a fuoco [Figura 1]. Sotto la finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione di imaging di laboratorio specifico conversione sotto all'opzione cattura impostazione discesa scheda [Figura 1]. Qui, l'impostazione di specifiche del laboratorio viene chiamato "pesce di Imaging".</li>
	<li>Inserire esemplare nell'ambito confocale e mettere a fuoco usando il corso e le manopole di regolazione fine.</li>
	<li>Aprire la finestra di messa a fuoco e individuare l'area desiderata di interesse (cioè gangli delle radici dorsali).</li>
	<li>Selezionare il laser c488 sotto il menu filtro impostato. Impostare l'esposizione a 300 ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2].</li>
	<li>La casella 3D nella sezione tipo di cattura . Nella sezione Capture 3D , selezionare utilizza la posizione corrente e controllare la gamma intorno a corrente. Nella stessa sezione, è possibile impostare l'intervallo a 35, il numero di aerei a 36 e le dimensioni di passaggio a 1. La gamma può essere aumentata o diminuita per ospitare per la profondità dell'area di imaging. Per il midollo spinale un valore compreso tra 35-40 stack è in genere sufficiente [Figura 5].</li>
	<li>Selezionare la posizione corrente [Figura 5].</li>
	<li>Fare clic su start nella parte inferiore della finestra di cattura per acquisire l'immagine.</li>
</ol>3. single-cell fotoconversione
<ol><li>Confocale software Open e selezionare le finestre di acquisizione e messa a fuoco [Figura 1]. Sotto la finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione di imaging di laboratorio specifico conversione sotto all'opzione cattura impostazione discesa scheda [Figura 1]. Qui, l'impostazione di specifiche del laboratorio viene chiamato "Pesce l'ablazione chip completo."</li>
	<li>Selezionare il laser c488 e c541 sotto il menu filtro impostato. Se non si utilizza lo stesso software di microscopio, trovare il menu per selezionare diversi laser e selezionare la 488 nm e 541 nm laser. Impostare le esposizioni ai 300 ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2]. Queste impostazioni di laser vengono selezionate in base a produrre abbastanza segnale fluorescente senza causare tossicità o photobleaching. Se è visualizzata la tossicità o photobleaching, ridurre potenza laser o esposizione.</li>
	<li>Aprire la finestra di messa a fuoco e fare clic sulla scheda photomanipulation nella finestra di messa a fuoco. Regolare di conseguenza i parametri laser. Modificare la potenza del laser dello stack a 2 e quindi fare clic su Vai. Modificare la dimensione del blocco Raster 1 e fare clic su imposta. Modificare le dimensioni di doppio clic a 4. Modificare la linea laser a v405 [Figura 3].</li>
	<li>Aprire le impostazioni di acquisizione avanzate nella finestra di acquisizione. Selezionare la scheda photomanipulation e modificare le ripetizioni fare doppio clic su 2. Fare clic su OK [Figura 4].</li>
	<li>Selezionare la scheda XY nella finestra di messa a fuoco. Ricontrollare i parametri laser dal passaggio 2 nella scheda photomanipulation [Figura 3, Figura 4]. Impostare impostazioni laser fotoconvertita la cella di interesse senza fotoconversione delle cellule circostanti.<ol>
<li>Se fotoconversione delle celle adiacenti è presente, ridurre la potenza del laser. Se fotoconversione delle cellule non si verifica, poteri del laser possono essere aumentate. Impostare in modo ottimale, potenza laser fotoconvertita solo la regione di interesse e non le zone circostanti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare la casella di timelapse sotto tipo di cattura. Quindi, fare clic su Start [Figura 6A].</li>
	<li>Una volta aperta la finestra di live della webcam, selezionare lo strumento cerchio sulla barra superiore [Figura 7]</li>
	<li>Disegnare un cerchio nella regione più centrale della cellula. Fare clic destro il cerchio disegnato, selezionare regione FRAPe attendere 3 secondi. L'area selezionata dovrebbe diventare dimmer [Figura 8]. Scegliere Interrompi acquisizione.</li>
	<li>Se più di un animale di imaging, tornare alla scheda XY nel menu di messa a fuoco e selezionare la posizione 2. Quindi, ripetere i passaggi 4.1-4.6.</li>
	<li>Per convertire una popolazione di cellule, seguire i parametri di protocollo e laser per la procedura 4.1-4.4 tranne invece di disegnare un cerchio di FRAP la regione di interesse, utilizzare lo strumento linea. Tracciare una linea sulla regione di interesse e FRAP la regione utilizzando gli stessi parametri sopra elencati.</li>
</ol>4. post-fotoconversione Imaging
<ol><li>Una volta che tutti i punti sono photoconverted. Selezionare lo stack di immagine standard di laboratorio specifiche impostazione descritta in precoversion passo 3 di imaging. Questo si trova sotto all'opzione cattura impostazione scheda a discesa nella finestra di cattura [Figura 5].</li>
	<li>Selezionare il laser c488 e impostare l'esposizione a 300ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2].</li>
	<li>Selezionare il laser c541 trovato sotto lo stesso menu come il laser c488. Impostare l'esposizione a 500 ms, laser di potenza a 10 e intensificare a 75 [Figura 9].</li>
	<li>La casella 3D nella sezione tipo di cattura . Nella sezione Capture 3D , selezionare utilizza la posizione corrente e controllare la gamma intorno a corrente. Nella stessa sezione, è possibile impostare l'intervallo a 35, il numero di aerei a 36 e le dimensioni di passaggio a 1. Il numero di serie può aumentare o diminuire per accomodare la profondità imaging desiderata [Figura 5].</li>
	<li>Se esistono più punti nella scheda di messa a fuoco XY, è possibile selezionare l'opzione multipunto elenco nella finestra di acquisizione. In caso contrario, selezionare la posizione corrente.</li>
	<li>Fare clic su start nella parte inferiore della finestra di cattura per acquisire l'immagine.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system.">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li><li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+delivery+of+the+green+fluorescent+protein+to+the+endoplasmic+reticulum+of+plant+cells.">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. 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F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling.">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li><li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone.">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).</li><li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment.">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li><li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones.">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development.">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In tessuti complessi, distinti tipi di cellule si organizzano in domini specifici. Recentemente sono state utilizzate tecniche a singole celle etichetta all'interno di queste strutture di grande tessuto1,2,3. Qui dimostriamo due tecniche che possono essere utilizzate allo stesso modo per visualizzare interazioni cellula singola e interazioni di popolazione delle cellule all'interno di tessuti complessi. Il vantaggio della tecnic...

Più celle distinte interagiscono per costruire e mantenere complessi tessuti animali e vegetali. Queste cellule sono spesso intercalati e difficili da distinguere dai vicini a livello di singola cellula senza microscopia ad alta risoluzione che richiedono la fissazione del tessuto. Tuttavia, per capire come questi si formano tessuti, sono mantenuti e diventare malato, è stato fondamentale per indagare come singole cellule all'interno del tessuto interagisce nel corso del tempo. Idealmente, questi esperimenti richiedono l'etichettatura delle singole cellule all'interno di un tessuto in maniera non invasiva, senza l'obbligo di fissazione. Gli scienziati ora hanno sviluppato numerose tecniche per realizzare questo compito1,2,3,4.
L'individuazione e l'attuazione della proteina fluorescente Medusa verde (GFP) è stato un approccio emozionante che ha permesso per l'etichettatura di cellule distinte in un tessuto ambiente1. Utilizzando promotori di cellula-specifico, è possibile selezionare geneticamente un sottoinsieme delle cellule che sono classificati come1. In alternativa, l'espressione virale indotta di GFP può essere utilizzato per utente-selezionato espressione della GFP3,4. Anche se molto utile, espressione genetica mediata di GFP non consente l'espressione selezionata dall'utente all'interno di un sottoinsieme delle cellule nel tessuto; e l'espressione virale di GFP, sebbene vantaggioso, può essere invasivo. Con l'avvento di GFP derivati e tecniche intelligente come Brainbow di esprimere distinte proteine fluorescenti più scarsamente all'interno dei tessuti, è diventato possibile visualizzare singole cellule e le interazioni tra loro nel complesso tessuto2, 5. Tuttavia, questi approcci marcare le cellule in modo casuale. Se l'esperimento desiderata richiede la visualizzazione di una singola cella o popolazione di cellule che è definita dallo sperimentatore, pertanto sono limitati. Con tali esperimenti, sarebbe vantaggioso avere una proteina fluorescente geneticamente espressa che può essere manipolata per distinguere, in maniera singola cella, e da altre cellule fluorescenti e non fluorescenti.
Per raggiungere questo obiettivo e visualizzare la biologia cellulare di cellule singole all'interno di un tessuto vivente complesso, la comunità scientifica utilizza fotoconversione unicellulare di distinte proteine fluorescenti6,7,8. Espressione di una proteina di fotoconvertibile (cioè, eos, kaede, ecc.) che passa dal verde al rosso fluorescente stato quando esposto ai raggi UV con geneticamente controllata (488 nm) luce, possiamo distinguere una singola cella da sua fluorescente contrassegnati i vicini6,7,8. Questo approccio utilizza un apparecchio attaccato al nostro microscopio confocale che possa indirizzare la luce da una pila di laser a una regione di diffrazione limitata di interesse. Con questa tecnica, possiamo etichettare o singole cellule o più grandi popolazioni in un modo definito dall'utente9,10,11. La tecnica è mini-invasiva rispetto alle iniezioni di singola cellula di GFP virale. Come un proof of concept, mostriamo che possiamo fotoconvertita singole cellule all'interno di un ganglio nel sistema nervoso periferico e fotoconvertita più grandi popolazioni come cellule situate sul lato ventrale del midollo spinale9,10, 11,12. Quindi possiamo visualizzare queste popolazioni di cellule photoconverted 24 h più tardi per guadagnare la comprensione nel loro movimento e la differenziazione durante lo sviluppo.

<table><tbody><tr><td>&lt;font class=&quot;font5&quot;&gt;Tg(&lt;em&gt;sox10:eos&lt;/em&gt;)&lt;/font&gt;&lt;font class=&quot;font0&quot;&gt; zebrafish animals&lt;/font&gt;</td><td></td><td></td><td>Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td></tr><tr><td>100 X 15 mm petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium</td><td></td><td></td><td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td></tr><tr><td>0.8% Low Melting Point Agarose</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>Needle dissecting probe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td><td>Fluka analytical</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td><td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td><td>3i spinning disk confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV light source (laser) for photoconversion</td><td>405 nm laser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

Tessuto animale e vegetale è composto da popolazioni distinte delle cellule. Queste cellule interagiscono nel tempo per costruire e mantenere il tessuto e possono causare la malattia quando perturbato. Gli scienziati hanno sviluppato tecniche intelligente per studiare le caratteristiche e dinamiche naturali di queste cellule all'interno del tessuto intatto esprimendo proteine fluorescenti in sottopopolazioni di cellule. Tuttavia, a volte, gli esperimenti richiedono più selezionato visualizzazione delle cellule all'interno del tessuto, a volte alla maniera unicellulare o popolazione di cellule. Per raggiungere questo obiettivo e visualizzare le singole celle all'interno di una popolazione di cellule, gli scienziati hanno utilizzato fotoconversione unicellulare di proteine fluorescenti. Per illustrare questa tecnica, vi mostriamo qui come dirigere la luce UV a una cella che esprimono Eos di interesse in un intatto, vivono zebrafish. Abbiamo quindi immagine quelle cellule di Eos+ photoconverted 24 h più successivamente per determinare come sono cambiate nel tessuto. Descriviamo due tecniche: singola cella fotoconversione e photoconversions delle popolazioni della cellula. Queste tecniche possono essere utilizzate per visualizzare le interazioni cellula-cellula, cellula-destino e differenziazione e migrazioni delle cellule, che lo rende una tecnica che è applicabile a numerose domande biologiche.

Fotoconversione di proteine fluorescenti può essere utilizzato per marcare le cellule distinte all'interno di un tessuto6. Per dimostrare questo, Tg(sox10:eos) pesce9 sono stati utilizzati per esprimere la proteina fotoconvertibile Eos sotto le sequenze regolatrici di sox10. Gli animali di Tg(sox10:eos) 48 hpf erano prima montato e poi ripreso per rilevare qualsiasi fotoconversione aspecifici che può essersi veri...

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Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo per mostrare come cella fotoconversione è raggiunto attraverso l'esposizione di UV ad aree specifiche che esprimono la proteina fluorescente, Eos, in animali vivi.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.0K Views.  University of Notre Dame. Qui, presentiamo un protocollo per mostrare come cella fotoconversione è raggiunto attraverso l'esposizione di UV ad aree specifiche che esprimono la proteina fluorescente, Eos, in animali vivi.

Video: Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biologia

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

Cella di rilevamento utilizzando proteine Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

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Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Cella di rilevamento utilizzando proteine Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish