Questo protocollo consente la modulazione simultanea di molti microRNA nelle cellule eucariotiche e si basa su un metodo molto semplice e flessibile che riduce al minimo i passaggi di clonazione molecolare. Questa tecnica ha implicazioni per lo studio delle interazioni funzionali del micro RNA in vitro, ma soprattutto fornisce una piattaforma per un uso più efficace dei microRNA in terapia. Lo abbiamo sviluppato e utilizzato principalmente nel contesto del cancro al cervello, ma si applica a tutte le malattie in cui sono coinvolte molteplici alterazioni dell'espressione genica.
Abbiamo testato i nostri geni trans artificiali in altri modelli come le linee di cancro al seno e alla tiroide che mostrano la riproducibilità di questa tecnica. Le conoscenze di base della bioinformatica e della biologia dei microRNA sono utili per questo protocollo, ma non indispensabili. Un approccio bioinformatico è importante per definire combinazioni di microRNA rilevanti e il TRK-11, mentre la familiarità con l'elaborazione del micro RNA misurabile è importante per capire come questi diversi microRNA possano essere assemblati in cluster di DNA artificiali che possono essere elaborati con successo una volta stabili alle cellule specifiche.
Per rivestire il piatto, sciogliere prima la poli-D-lisina in acqua a una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro. Versare la soluzione nel piatto alla quantità di un millilitro di soluzione per 25 centimetri quadrati di superficie. Ruotare il piatto per assicurarsi di copertura di tutto il piatto.
Dopo sei ore aspirare la soluzione di poli-D-lsina e risciacquare due volte con PBS. Placcare le cellule staminali neurali umane nella quantità di 100.000 cellule per cinque millilitri del mezzo, sia nel mezzo delle cellule staminali, nel mezzo di differenziazione astrocitica o nel mezzo di differenziazione neuronale. Dopo la placcatura cellulare, posizionare il piatto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per una settimana e procedere all'analisi dell'espressione del micro RNA secondo il manoscritto.
Per coltura di cellule simili a staminali di glioblastoma GBM-34, iniziare con una per dieci alla quinta cellula e cinque millilitri di mezzo neurobasale in un pallone ad attacco basso 25 centimetri quadrati. Posizionare il pallone in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. 48 ore dopo la placcatura, aggiungere concentrazioni raddoppiate di agente alchilante di DNA temozolomide ogni sette giorni.
Iniziare con l'aggiunta di cinque micromolari TMZ integrati in cinque millilitri medi per cinque giorni. Dopo cinque giorni, rimuovere il mezzo e sostituirlo con mezzo fresco senza temozolomide per consentire alle cellule sopravvissute di riprendersi. Dopo 48 ore, aggiungere 10 temozolomide micromolare e incubare per altri cinque giorni.
Ripetere il trattamento del raddoppio temozolomide fino a raggiungere la concentrazione di almeno 100 micromolari e le cellule diventano resistenti al farmaco. Dopo l'induzione della resistenza, mentire le cellule usando 1 millilitro di reagente di lisi. Estrarre l'RNA totale e analizzare l'espressione dei microRNA specifici in base al manoscritto.
Per ottenere il targetome previsto di ogni micro RNA precedentemente definito, utilizzare strumenti di previsione del targeting per micro RNA. Dalla prima pagina di TargetScan, selezionare il micro RNA di interesse dal menu a discesa prepopolato. Fare clic sul pulsante invia.
Scaricare l'elenco di destinazioni risultante come foglio di calcolo utilizzando il collegamento alla tabella di download. Per ridurre le possibilità di previsioni false positive, includere solo le destinazioni all'interno della colonna siti conservati e dell'analisi downstream. Ulteriori programmi di previsione del micro RNA ottengono ulteriore rigore e includono solo destinazioni comuni a tutti gli algoritmi.
Quindi, apri la suite ToppGene 20. Per valutare l'arricchimento di percorsi comuni a ciascun micro RNA, incollare l'elenco degli obiettivi ottenuti nella finestra dei set di geni di training. Fate clic su Simbolo HGNC (HGNC Symbol) come tipo di voce.
Fare clic su Invia e inizia. Il programma fornisce una tabella di output che mostra le categorie GO più significative per l'elenco inserito dei geni. Per stabilire infine il contributo di ogni micro RNA alla regolazione di un percorso comune o di un processo cellulare, aprire la funzione venn-diagramma fornita nel sito web bioinformatica e genomica evolutiva.
Controllare ogni targetome ottenuto rispetto all'elenco completo dei geni coinvolti nello specifico processo cellulare. Se gli RNA di messaggistica di destinazione per ogni microRNA di interesse si trovano nelle rispettive finestre, caricare copia-incolla l'elenco. Assegnare un nome a ogni elenco con un identificatore univoco.
Fare clic su Invia. Il programma fornisce un output visivo di un diagramma venn con numeri di geni in ogni settore e un elenco completo di RNA messaggero per ogni sottoinsieme e combinazioni di intersezioni. Per raggruppare i micro RNA selezionati in un gene trans funzionale, ottenere un'impalcatura transgenica basata sul locus a grappolo miR-17-92.
Ottenere la sequenza nucleotidica dal browser del genoma ensemble. Selezionare la sequenza di nucleo di circa 800 coppie di basi che comprende tutti e sei i forcine a micro RNA codificati del locus e almeno 200 sequenze di fianco nucleotidici sia a monte che a valle della sequenza del nucleo. Incollare la sequenza in qualsiasi programma di modifica delle parole.
Definire la sequenza di ciascuno dei sei perni di capelli nativi recuperandoli in base miR. Contrassegnare ognuna di queste sequenze entro l'intervallo della sequenza di base precedentemente identificata. Tutte le sequenze tra ogni tornante rappresentano sequenze distanziale.
Successivamente, ottenere le sequenze di forcine di microRNA destinate ad essere sovraes espresse nel gene trans dalla base miR. Si notano con attenzione i nucleotidi specifici che si trovano nei siti di scissione del microprocessore. Elimina le sequenze di forcine native dalla sequenza centrale ad eccezione di tre o cinque nucleotidi alle estremità a cinque e te di ogni tornante che fungerà da accettore per i nuovi tornanti.
Incollare le sequenze di forcine dei microRNA desiderati per sostituire le forcine precedentemente eliminate. Aggiungere le sequenze di restrizione desiderate in entrambe le regioni di fianco del gene trans per facilitare la sottoclonazione in vettori di distribuzione di scelta. Verificare che le sequenze di restrizione scelte non siano presenti all'interno della sequenza stessa.
Per verificare la struttura bidimensionale del gene trans, copiare l'intera sequenza transgenica nel programma software di previsione della struttura dell'RNA RNA Webfold. Selezionare le impostazioni standard del programma e fare clic su Procedi. Analizzare l'uscita grafica, in particolare per la presenza di forcine ben definite in presenza di strutture staminali a doppio filamento che sono almeno 11 nucleotidi prossimali al sito di scissione del microprocessore.
Inoltre, cerca l'assenza di punti di ramificazione all'interno delle sequenze di forcine. A questo punto, il gene trans è pronto per essere prodotto dalla sintesi genica e clonato nei vettori di somministrazione desiderati. Questo metodo ha permesso la caratterizzazione di un modulo di tre micro RNA che sono costantemente regolati nei tumori cerebrali, che sono co-espressi specificamente durante la differenziazione neuronale.
I modelli di co-espressione dei moduli di micro RNA durante lo stress genotossico sono stati confermati e hanno suggerito una forte attività sinergica tra questi tre microRNA. Il gene trans progettato potrebbe contemporaneamente riassumere l'espressione dei tre microRNA nelle cellule del glioblastoma, sia in vitro che in vivo, con interferenze significative nella biologia tumorale e promettente applicabilità traslazionale. Inoltre, l'ammasso transgenico era funzionale anche in un modello di cancro al seno.
I requisiti cruciali di questo protocollo sono il mantenimento delle dimensioni originali della scissione del processore nel gene trans. E assicurarsi che la struttura ad anello del gambo dei forcine chimeriche micro RNA sia preservata. Con questo metodo, possiamo concentrare più geni di microRNA biologicamente attivi in sequenze di DNA molto brevi che possono letteralmente essere inserite in vitro in qualsiasi vettore di somministrazione per uso di terapia genica.
Questo metodo è ideale per studiare l'interazione funzionale tra diversi microRNA e per interferire con percorsi cellulari multifattoriali complessi che altrimenti richiederanno più combinazioni di farmaci.
