Il sistema organoide 3D è considerato fisiologicamente più rilevante dei saggi 2D e può fornire preziose informazioni sulla biologia che altrimenti sarebbe difficile da acquisire. Questo è un sistema adattabile in cui possiamo testare manipolazioni farmacologiche e genetiche con meno tempo e un costo significativamente inferiore rispetto all'uso di un approccio in vivo. La prova a matrice è molto difficile da gestire, in quanto si solidifica quando raggiunge la temperatura ambiente.
Può essere disegnato attraverso una pipetta solo quando è liquido e deve essere mantenuto sul ghiaccio. L'integrità dell'anello è importante da mantenere. Se la struttura viene interrotta, ciò può influire negativamente sulla crescita organoide e si può facilmente perdere materiale quando si cambia il supporto.
Iniziare questa procedura con la preparazione di cellule epiteliali della prostata basale e luminale del topo come descritto nel protocollo di testo. Lavare il pellet cellulare in 500 microlitri di mezzi organoidi del mouse, quindi sospendere di nuovo il pellet a una densità cellulare di 1.000 celle per microlitro. Per preparare miscele master, mescolare le cellule epiteliali sospese in mezzi organoidi del mouse con il gel matrice per generare una miscela finale che contiene il 25% di cellule nei supporti e il 75% di gel matriciale.
A seconda dell'applicazione a valle, le cellule basali sono tipicamente placcate ad una concentrazione da 100 a 2.000 cellule per 80 microlitri, mentre le cellule luminali sono placcate ad una concentrazione da 2.000 a 10.000 cellule per 80 microlitri. Per ogni miscela cellulare, aggiungere 80 microlitri del gel matrice per pozzo di una piastra da 24 po '. Pipettare una goccia sulla metà inferiore della parete del pozzo evitando il contatto diretto con il rivestimento in poli-ema.
Dopo aver aggiunto il gel matrice, ruotare la piastra per consentire alla miscela di celle in gel matrice di formare un anello attorno al bordo del pozzo. Posizionare la piastra da 24 porri in un lato destro dell'incubatore di 37 gradi Celsius, 5%C02 per 10 minuti per consentire al gel matrice di indurirsi parzialmente. Dopo aver incubato per 10 minuti, capovolgere la piastra da 24 pozzi e incubare per altri 50 minuti per consentire al gel matrice di indurirsi completamente.
Quindi, aggiungere 350 microlitri di supporti organoidi del mouse pre-riscaldati per quanto riguarda la caduta al centro di ogni pozzo. Dopo aver aggiunto il supporto, restituire la piastra da 24 po 'all'incubatore. Per reintegrare i supporti organoidi del mouse, inclinare la piastra a 24 pozzi con un angolo di 45 gradi e rimuovere delicatamente i supporti esistenti dal centro di ogni pozzo utilizzando una pipetta P1000 evitando l'anello del gel matrice.
Aggiungere 350 microlitri di supporti organoidi del mouse preri warmed come prima. Si consiglia di aggiungere un volume maggiore di mezzi agli organoidi coltivati per più di cinque giorni per prevenire un rapido esaurimento dei nutrienti chiave e dei fattori di crescita. Rimuovere i supporti da ciascuno come prima.
Per raccogliere gli organoidi, far esplodere ripetutamente il gel a matrice pipettando un millilitro di mezzi contenenti dispasi pre-riscaldati direttamente sull'anello del gel matrice fino a quando l'intero anello non viene slogato. Trasferire la miscela organoide del gel a matrice slogata in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo la digestione completa come descritto nel protocollo di testo, aggiungere la salina tamponata con fosfato al pellet organoide e sospendere di nuovo facendo delicatamente scorrere.
Pellettare gli organoidi per centrifugazione a 800 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante utilizzando una micro-pipetta. Sospendere di nuovo i pellet organoidi in 100 microlitri di tampone di lysis proteica per 10 microlitri di volume di cellule imballate. Scorrere per sospendere di nuovo.
Ora, sonicare gli organoidi immergendo i tubi nel ghiaccio bagnato e applicando delicatamente la punta del dismembratore sonico all'esterno del tubo di micro-centrifuga. Sonicare per 40 secondi a 20 kilohertz prima di procedere verso western blotting con protocolli stabiliti. Per raccogliere gli organoidi prostatico dalle piastre a 24 pozzi, rimuovere il supporto da ciascuno come prima.
Digerire il gel matriciale incubando con 500 microlitri di mezzi contenenti dispasi per 30 minuti in un incubatore di 37 gradi Celsius, 5%CO2. Raccogliere le sospensioni organoidi digerite in un tubo di micro-centrifuga. Quindi, pellettare gli organoidi per centrifugazione a 800 volte G per tre minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante.
Per eseguire la colorazione immunofluorescente a montaggio intero degli organoidi prostatici, aggiungere prima 500 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS. Incubare gli organoidi per due ore a temperatura ambiente con tremori delicati. Dopo aver lavato il pellet come descritto nel protocollo di testo, aggiungere un microgrammo per millilitro di macchia DAPI nella soluzione di blocco e incubare per due ore a temperatura ambiente.
Proteggere il campione dalla luce durante l'incubazione da questo passo avanti. Dopo la centrifugazione degli organoidi come prima, aggiungere anticorpi primari nella soluzione di blocco e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con tremori delicati. Pellettare nuovamente gli organoidi e lavare il pellet con un milliter di PBS per 15 minuti con un delicato scuotimento.
Ripetere questa procedura di lavaggio due volte. Quindi aggiungere anticorpi secondari nella soluzione di blocco e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con tremori delicati. Dopo l'incubazione, pellet gli organoidi e lavare il pellet per altre due volte.
Aggiungere un millilitro di saccarosio al 30% in PBS con 1%Triton X-100 agli organoidi pellettati. Quindi incubare per due ore a temperatura ambiente con tremori delicati. Dopo aver pellettato nuovamente gli organoidi, aggiungere un millimetro di saccarosio al 45% in PBS con 1%Triton X-100 e agitare delicatamente per due ore a temperatura ambiente.
Quindi, ripetere la procedura, ad eccezione di aggiungere un millilitro di 60% di saccarosio in PBS con 1%Triton X-100. Pellettare gli organoidi per centrifugazione a 800 volte G per tre minuti a temperatura ambiente e rimuovere il 95% del supernatante. Osservare il pellet sotto la luce UV per confermare che non è stato perso durante la rimozione del supernatante.
Il pellet diventa più sciolto man mano che la concentrazione di saccarosio diventa più alta. Trasferire da 10 a 20 microlitri della sospensione rimanente in una coverlip a camera e procedere alla microscopia confocale. Le cellule basali e luminali formano organoidi con morfologie distinte.
Mentre la maggior parte degli organoidi di derivazione basale sono di dimensioni simili dopo sette giorni di coltura, gli organoidi di derivazione luminale mostrano una significativa eterogeneità. Inoltre, la maggior parte degli organoidi di derivazione basale contengono lumen circondati da epitelio multistrato, mentre gli organoidi di derivazione luminale variano in morfologia dalla cavità con epitelio a strato singolo al solido con corde multistrato di cellule che non canalizzano. L'analisi western blot ha rivelato che gli organoidi basali e di derivazione luminale mantengono caratteristiche associate alle cellule primarie basali e luminali.
Gli organoidi di derivazione basale esprimono livelli più elevati del marcatore basale citokeratina 5, mentre gli organoidi di derivazione luminale esprimono livelli più alti del marcatore luminare citokeratina 8. Sia i marcatori basali che luminali sono stati rilevati negli organoidi di derivazione basale e luminale nella popolazione sfusa, forse suggestivi di differenziazione. Gli organoidi derivati dal basale contengono epitelio multistrato, con strati esterni che esprimono alti livelli del marcatore basale p63 e strati interni con livelli non rilevabili.
Gli strati esterni esprimono anche livelli moderati del marcatore luminale citokeratina 8, e gli strati interni hanno livelli elevati. Mentre tutte le cellule in organoidi di derivazione luminale a strato singolo macchiano positivamente per la citocheratina 8, solo alcune cellule contenevano p63 nucleare. Prestare attenzione quando si maneggia il gel a matrice per assicurarsi che non si indurisca prima di placcare le cellule nella coltura organoide.
Il DAPI utilizzato per la microscopia può causare irritazione cutanea. Anche la luce UV può essere dannosa. Sono essenziali adeguati dispositivi di protezione individuale.
Possiamo raccogliere l'RNA dagli organoidi per eseguire il sequenziamento dell'RNA, che ci dirà come cambiano i profili di espressione genica durante la formazione organoide o in risposta alla manipolazione. Questo modello ha permesso al campo prostatico di avere un saggio ex vivo riproducibile per studiare gli aspetti fondamentali della biologia epiteliale e identificare i regolatori nello sviluppo e nella differenziazione.
