Descriviamo strategie e protocolli passo-passo per stabilire organoidi seriali derivati dal paziente 3D del cancro alla prostata metastatico osseo. I nostri protocolli ottimizzati sono pratici per impostare colture 3D per esperimenti utilizzando materiale di partenza limitato direttamente da pazienti o tessuti tumorali xenograft derivati dal paziente. Gli organoidi 3D di questo protocollo possono essere utilizzati come modelli ex vivo per comprendere i meccanismi di base della patologia del cancro alla prostata metastatica ossea e per testare il trattamento.
Il supporto di coltura organoide 3D in questo protocollo è specifico per le cellule derivate dalla prostata. Altre parti dei nostri protocolli sono applicabili a diversi tipi di tessuti tumorali e siti metastatici. La tecnica di doming può rivelarsi la parte più difficile di questo processo.
La pratica della tecnica di cupola garantirà una dimensione costante della miscela a cupola di organoidi, mezzi e Matrigel e ridurrà al minimo la formazione di bolle durante la sospensione del campione. Dimostrando visivamente questo metodo fornisce una migliore comprensione di come gestire il Matrigel viscoso per coltivare con successo organoidi a bassa densità da un basso numero di cellule. Iniziare riutilizzando il pellet cellulare nel volume appropriato della membrana basale per una configurazione della piastra da 24 poggiamenti.
Pipettare delicatamente su e giù per assicurarsi che le cellule vengano rimostrate, quindi pipettare il volume appropriato della sospensione cellulare al centro di una piastra di coltura tissutale preri warmed. Invertire la piastra e posizionarla immediatamente a testa in giù nell'incubatore di coltura cellulare impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 15 minuti. Pipettare il volume appropriato di mezzo prerischiato contenente 10 micromolare Y-27632 diidrocloruro in ogni pozzo.
Per formare una cupola galleggiante dalla cupola rotonda attaccata, staccare la cupola dalla piastra usando un raschietto per celle. Tagliare un pezzo di pellicola di paraffina da due per quattro pollici e posizionarlo sopra i divot di una punta vuota che tiene rack da una scatola di punta in pipetta di plastica da un millilitro. Utilizzare un dito indice guantato per premere delicatamente il film di paraffina per rintracciare i divot facendo attenzione a non sfondare il film.
Spruzzare il film di paraffina con 70%etanolo e accendere la lampada UV nel cappuccio di coltura cellulare per sterilizzare il film preparato per almeno 30 minuti. Nel frattempo, ha rimescolato le cellule pre-lavorate in 20 microlitri di membrana basale. Quindi pipettare la sospensione nei divots formati nel film di paraffina.
Posizionare le perline solidificate e la pellicola di paraffina in una piastra a sei pozzi e pipetta da tre a cinque millilitri di mezzo prerimolato contenente 10 micromolare Y-27632 diidrocloruro in ogni pozzo mentre si spazzolano delicatamente le perline dal film di paraffina. Per elaborare gli organoidi per l'istologia, rimuovere i supporti esistenti dal pozzo facendo attenzione a non aspirare le cupole a membrana del seminterrato. Aggiungere un volume uguale di soluzione di recupero cellulare e incubare la piastra per 60 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, spodesare la cupola della membrana basale usando una pipetta e schiacciarla con una punta di pipetta. Raccogliere la cupola dissociata e la soluzione di recupero cellulare in un tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 300 volte g in quattro gradi Celsius per cinque minuti, quindi rimuovere il supernatante e rlo da parte.
Salvare tutti i supernaganti fino alla fase finale quando la presenza di organoidi è confermata al volume desiderato di PBS freddo e pipettare delicatamente su e giù per rimuovere meccanicamente il pellet senza interrompere gli organoidi. Ripetere la centrifugazione e rimuovere il supernatante. Fissare il pellet in un volume abbinato del 4%PFA per 60 minuti a temperatura ambiente.
Dopo la fissazione, ripetere il passaggio di centrifugazione e il lavaggio PBS. Quindi aggiungere lentamente 200 microlitri di agarosio caldo al 2% e staccare immediatamente ma delicatamente il pellet cellulare dalla parete del tubo senza interromperlo utilizzando un ago calibro 25 attaccato a una siringa da un millilitro. Per il metodo di spin down dell'agarosio, è fondamentale staccare il pellet cellulare dalla parete del tubo subito dopo aver aggiunto agarosio utilizzando un ago calibro 25.
Una volta che l'agarosio si è completamente solidificato, staccarlo dal tubo con un ago calibro 25 attaccato a una siringa da un millilitro e trasferirlo in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Riempire il tubo con il 70% di etanolo e procedere con il protocollo convenzionale per la disidratazione dei tessuti e l'incorporamento della paraffina. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per stabilire organoidi 3D da modelli di xenograft derivati dal paziente di cancro alla prostata metastatica ossea e direttamente dal tessuto tumorale.
Gli organoidi mostravano diversi fenotipi che si manifestavano come cisti, sferoidi e organoidi di maggiore complessità. Un'intera cupola di membrana basale e organoidi può essere vista in un'immagine cucita da 25 immagini di ingrandimento ad alta risoluzione e 10X. Per indagare ulteriormente il tessuto tumorale, la citochimica immunofluorescente è stata eseguita su una sezione di paraffina spessa cinque micrometri di organoidi mirati al marcatore cellulare epiteliale basale citokeratina-5, marcatore di cellule epiteliali luminali citokeratina-8 e DAPI.
Questo protocollo può essere ottimizzato per altre applicazioni come l'assorbimento occidentale, la co-coltura e la citometria del flusso per esplorare le caratteristiche degli organoidi 3D e gli effetti dei trattamenti farmacologici. Questi esperimenti potrebbero riguardare meccanismi di resistenza ai farmaci e l'efficacia di nuove terapie da sole o in combinazione con le terapie attuali. Gli organoidi 3D di questa tecnica mantengono l'eterogeneità tra soggetti e intra-soggetti e quindi sono un modello più accurato della malattia nei pazienti.
Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare meccanismi di resistenza ai farmaci, tumorigenesi, metastasi e terapie che possono essere più prevedibili della progressione della malattia nei pazienti e della loro risposta alla terapia.
