Gli organoidi prostatico sono un eccitante sistema in vitro per lo studio dello sviluppo e delle malattie. Superano le sfide delle linee cellulari immortalate e offrono un'alternativa economica ai modelli animali. Possono essere coltivati da cellule prostatiche umane, come abbiamo dimostrato in questo protocollo, così come cellule prostatiche del topo, come un sistema di modelli preclinali rilevanti per la malattia.
Molti laboratori hanno descritto metodi ed endpoint di impostazioni cultura utili. Ma speriamo di riunire questi dettagli in un unico protocollo e dimostrare i passaggi particolarmente impegnativi per i nuovi utenti. Man mano che le tecniche migliorano, gli organoidi del cancro alla prostata possono essere coltivati da campioni di pazienti come approccio di medicina di precisione per modellare le malattie e rispondere alle terapie.
Le condizioni di coltura sono specifiche degli organoidi prostatico, tuttavia molti degli endpoint sono stati adattati da altri tipi di tessuto. Un utente potrebbe adattare parti di questo protocollo al proprio tipo di cella di interesse. Iniziate questo esperimento coltivando cellule epiteliali in tavole a 96 pozzi codificate in gel a matrice come descritto nel manoscritto.
Per raccogliere gli organoidi dalle piastre dopo 12 giorni, rimuovere il mezzo dai pozzi senza disturbare il gel a matrice. Quindi aggiungere immediatamente circa 200 microlitri di proteasi neutra ad ogni pozzo a circa un rapporto uno-a-due di gel matrice a proteasi neutra. Incubare il piatto per 20 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi pipettare su e giù per dissociare meccanicamente la miscela e incubare di nuovo per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, trasferire la miscela gel-cella a matrice proteasi neutra da alcuni pozzi a un tubo di microcentrifugo. Pellettare le cellule per centrifugazione a 300 volte g per tre o cinque minuti.
Rimuovere il supernatante e salvare il pellet organoide per le analisi successive. Per creare stampi per l'incorporamento, ritagliare una piccola sezione di una punta di pipetta da 1.000 microlitri per creare un cilindro che contiene 50 microlitri. Quindi dalla parte più ampia della stessa punta, fare un secondo stampo più ampio che si adatta intorno al primo stampo.
Per creare un blocco freddo, avvolgere un impiglio di ghiaccio con nastro adesivo verso l'alto. Quindi aderire gli stampi perpendicolarmente al nastro. Per incorporare gli organoidi in un tappo di gel istologico per la lavorazione, lavare prima il pellet organoide precedentemente ottenuto con un millilitro della soluzione di sale bilanciato di Hank.
Dopo aver centrifugato a 300 volte g per tre o cinque minuti, rimuovere il supernatante. Quindi aggiungere da 30 a 50 microlitri di gel istologico liquido al pellet organoide e mescolare delicatamente pipettando lentamente su e giù per rimescolare il pellet. Trasferire questa miscela in uno stampo sul blocco freddo e lasciare raffreddare e solidificare il campione in una spina.
Successivamente, utilizzare uno stantuffo per spingere la spina fuori dal piccolo stampo e al centro dello stampo più grande e riempirla pipettando chiaro 2%agar intorno alla spina. Per contrassegnare la parte superiore del campione, pipetta istologica tinta di colorante 2%agar sopra la spina. Una volta raffreddato l'agar, utilizzare uno stantuffo per trasferire la spina in una cassetta istologia.
Etichettare la cassetta con una matita e posizionarla in formalina tamponata neutra al 10% per la fissazione notturna. Il giorno seguente, trasferire la cassetta dalla formalina tamponata al 10% neutra al 70% di etanolo di grado istologico, e elaborarla ulteriormente e incorporarla in paraffina. Iniziare tagliando la base del blocco con uno spessore di 10 micrometri.
Una volta visualizzata una sezione che contiene l'area della spina, interrompere il taglio. Bloccare il rotore del microtomo e trasferire il blocco sul ghiaccio per raffreddare. Spostare la lama in una nuova porzione inutilizzata.
E trasferire il blocco di nuovo al morsetto. Sbloccare la macchina e iniziare a tagliare a cinque micrometri per sezione. Usa le pinzette per trasferire la sezione al bagno d'acqua Celsius di 40 gradi e consentirgli di diffondersi.
Immergere uno scivolo verticalmente nell'acqua per trasferire la sezione su di esso. Quindi osservare lo scivolo sotto un microscopio a campo luminoso per assicurarsi che nella sezione sia presente un organoide. Cuocere durante la notte a 45-50 gradi Celsius, quindi procedere con la colorazione come descritto nel manoscritto.
Inizia questa parte dell'esperimento con pozzi inutilizzati della piastra rivestita in gel a matrice di 96 pozzi con organoidi. Pipettando contro il lato del pozzo, lasciando spazio tra il supporto e il gel matrice, rimuovere con cura il maggior numero possibile di mezzi senza interrompere la coltura organoide. Utilizzare una punta di pipetta rifilata da 1.000 microliter, pre-bagnata con PBS per disegnare una goccia di gel matrice che contiene gli organoidi di interesse.
Distribuire la goccia al centro di uno scivolo da camera. Ad occhio nudo, aspirare il supporto in eccesso e il gel a matrice dallo scivolo della camera utilizzando una pipetta a punta fine. Per promuovere l'aderenza organoide al vetro e prevenire la perdita di campioni durante le successive fasi di lavaggio.
Posizionare la diapositiva in un incubatore di 37 gradi Celsius per 30-45 minuti. Pipettando lentamente per evitare il distacco dal piatto, aggiungere 200 microlitri di 1X PBS per lavare gli organoidi per cinque minuti a temperatura ambiente con tremori delicati. Rimuovere con cura il PBS 1X e aggiungere 200 microlitri di paraformaldeide al 4%.
Fissare per 30 minuti a temperatura ambiente con tremori delicati. In PFA, lavare e procedere con le successive fasi di permeabilizzazione e colorazione come descritto da questo protocollo. Montare e immagine immediatamente.
Lo scivolo appena tagliato non macchiato mostra chiaramente gli organoidi prostatici primari umani, mentre nello scivolo secco non macchiato, gli organoidi appaiono traslucidi e sono più difficili da rilevare al microscopio a campo luminoso. La colorazione di ematossilina ed eosina mostra un organoide prostatico primario umano rotto da cattiva gestione, come pipettazione aggressiva, protocollo di elaborazione errato rispetto a un organoide ben gestito. L'organoide prostatico primario umano era fissato alla formalina, incorporato nella paraffina, sessato e macchiato con citocheratina basale 5 e citocheratina luminare 8, p63 basale e citocheratina luminare 8, e immaginato con microscopio confocale.
Un organoide prostatico primario umano a tutto montato era macchiato con citocheratina basale 5 o citocheratina luminale 8, e controsostenibile con phalloidina e DAPI, e immaginato con microscopio confocale. Un organoide a cellule prostatiche primarie umane montato su intero era macchiato con Edu con etichetta fluorescente e controsostenibile con Hoescht, e immaginato con microscopio confocale. È importante visualizzare i tuoi organoidi durante tutta la procedura.
Dopo aver raccolto le sezioni, assicurarsi di visualizzare i campioni sulla diapositiva e assicurarsi di osservare gli organoidi durante il montaggio intero. Dopo aver raccolto gli organoidi dal gel matrice, è possibile montarli interamente e utilizzare saggi commerciali o dissociarli su singole cellule per la citometria a flusso o il sequenziamento a cella singola. La cultura 3D offre ai ricercatori un nuovo modo di studiare i tessuti nell'impostazione di un piatto da laboratorio.
Può essere applicato all'organogenesi o alla comprensione della patologia della malattia di un paziente. Quando si lavora con campioni di pazienti, prestare sempre attenzione e maneggiare i materiali come potenziale di esposizione agli agenti patogeni trasmessa dal sangue.
