Questo protocollo è significativo in quanto mostra una metodologia passo-passo per isolare l'epitelio uterino altamente puro dall'utero del topo per la coltura di organoidi endometriali. Questo metodo utilizza in modo efficiente la dissociazione enzimatica e meccanica per isolare l'epitelio uterino. Le tecniche sono state ottimizzate per stabilire, trattare e analizzare gli organoidi dell'epitelio endometriale derivati dall'epitelio isolato.
Iniziare scongelando la matrice di gel sul ghiaccio per circa una o due ore prima dell'uso. Quindi sezionare il topo eutanasia praticando un'incisione mediana sull'addome usando le forbici e staccando delicatamente la pelle per esporre lo strato peritoneale sottostante. Individuare le corna uterine spostando delicatamente i cuscinetti di grasso addominale da parte e tenere le corna uterine alla giunzione cervicale prima di tagliarle lungo il grasso mesenterico.
Dopo la dissezione dell'utero del topo, rimuovere accuratamente il tessuto adiposo dal corno uterino con piccole forbici. Una volta fatto, tagliare ogni corno uterino in piccoli frammenti, ciascuno dei quali misura circa quattro o cinque millimetri. Mettere tutti i frammenti uterini da un utero in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 0,5 millilitri di tripsina all'1%.
Quindi incubare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore di coltura tissutale umidificata a 37 gradi Celsius per circa un'ora per la separazione enzimatica dell'epitelio endometriale dallo stroma sottostante. Dopo l'incubazione, trasferire i frammenti uterini su una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri contenente un millilitro di soluzione tamponata fosfato di Dulbecco o DPBS. Quindi, separare l'epitelio uterino dal tubo uterino al microscopio a dissezione tenendo un'estremità di un frammento uterino con la pinza e facendo scorrere delicatamente la punta della pipetta longitudinalmente attraverso il frammento, schiacciando l'epitelio dall'altra estremità del tubo uterino.
Quindi osservare i fogli epiteliali separati dal frammento uterino al microscopio a dissezione. Quindi, trasferire delicatamente tutti i fogli epiteliali nello stesso tubo da 1,5 millilitri usando la pipetta da un millilitro. E pellet i fogli epiteliali dissociati mediante centrifugazione a 375 x g per cinque minuti.
Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere il pellet cellulare in 0,5 millilitri di 2,5 milligrammi per millilitro di collagenasi più due milligrammi per millilitro di soluzione di DNA. Pipettare su e giù circa 10 volte o fino a raggiungere una sospensione a cella singola. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di DMEM F / 12 più siero bovino fetale al 10% o FBS più antibiotici e centrifugare le cellule per cinque minuti a 375 x g.
Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in un millilitro DMEM / F12 più 10% FBS più antibiotici e centrifugare le cellule. Posizionare la matrice di gel sul ghiaccio fino a quando non è pronta. Quindi, rimuovere il surnatante dalle celle della centrifuga e risospendere il pellet cellulare utilizzando 20 volte il volume della matrice di gel senza introdurre le bolle.
Lasciare riposare la sospensione cellulare della matrice di gel a temperatura ambiente per circa 10 minuti. Una volta che la sospensione della cella della matrice di gel diventa un gel semi-solido, utilizzare una micropipetta P200 con una punta larga da 200 microlitri e aspirare delicatamente 25 microlitri della sospensione cellulare della matrice di gel. Erogare tre cupole separate da 25 microlitri per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e lasciare polimerizzare la matrice di gel per 15 minuti e un incubatore di coltura tissutale umidificata a 37 gradi Celsius.
Dopo che la matrice di gel è stata polimerizzata, aggiungere 750 microlitri di mezzo organoide a ciascun pozzetto contenente cupola della matrice di gel e incubatore a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura di tessuti umidificati. Le immagini a contrasto di fase degli organoidi endometriali di topo hanno mostrato che la separazione delle cellule epiteliali e stromali ha prodotto campioni con non più del 10-15% di contaminazione del tipo di cellula opposta. Le cellule epiteliali endometriali sono state assemblate in organoidi entro tre o quattro giorni.
Gli organoidi endometriali incorporati in paraffina sezionata in formalina sono stati visualizzati da colorazioni di ematossilina ed eosina, che mostravano il singolo strato di epitelio e centri cavi, i lumi degli organoidi. L'imaging al microscopio a fluorescenza ha mostrato che tutte le cellule degli organoidi erano citocheratine 8-positive e contenevano DAPI, indicando che la fissazione, l'incorporazione e l'elaborazione degli organoidi endometriali è compatibile con l'immunocolorazione basata sugli anticorpi. La PCR quantitativa in tempo reale ha mostrato che la stimolazione con estradiolo nanomolare 10 ha aumentato l'espressione di lipocalina 2, lattoferrina e recettore del progesterone negli organoidi epiteliali, indicando che gli organoidi epiteliali endometriali possono essere utilizzati con successo per misurare i cambiamenti di espressione genica in risposta all'estradiolo.
È importante assicurarsi che si ottenga una chiara separazione dell'epitelio endometriale durante la fase di dissociazione meccanica. Si dovrebbe essere in grado di osservare l'epitelio che emerge dal tubo uterino. Altri metodi includono la creazione degli organoidi epiteliali mediante incapsulamento in una matrice di gel.
Se lo si desidera, il compartimento stromale può essere ulteriormente digerito per creare co-colture stromali epiteliali 3D. Il metodo può aiutare a rispondere alle domande sui segnali che controllano il rinnovamento dell'endometrio. Potrebbe aiutare a trattare le malattie nelle donne, come l'endometriosi, la perdita di gravidanza e il cancro.
