Questo protocollo è significativo perché consente il confronto della microvascolarizzazione tra diverse regioni del sistema nervoso centrale, nonché tra individui diversi. Questa tecnica di isolamento delle microvezze può essere completata in un solo giorno ed elimina la necessità di ultracentrifugazione e dissociazione enzimatica. Rimuovere le meningi e il plesso coroideo può essere difficile.
Assicurati di lavorare lentamente e con attenzione per garantire la completa rimozione di ogni tessuto. Per la dissezione del tessuto del SNC da un piccolo campione di vertebrato lissencefalico, posizionare il cervello raccolto in un tubo conico da 15 millilitri contenente soluzione di MV-1 sul ghiaccio e utilizzare le forcelle per recuperare l'ipofisi dalla sella turcica del cranio. Posizionare l'ipofisi in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri di soluzione MV-1 sul ghiaccio e rimuovere la pelle e il muscolo per esporre la colonna vertebrale.
Dopo aver rimosso gli arti, la gabbia toracica e gli organi interni, utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 18 per sciacquare la colonna vertebrale con una soluzione MV-1 fresca, in direzione caudale-rostrale in tutto il foro vertebrale lombare. Quindi posizionare il midollo spinale in un tubo da 5 millilitri contenente soluzione MV-1 fresca. Quindi, posizionare il cervello in una piastra di Petri sotto il microscopio sezionante e rimuovere le meningi con puntura a doppia prozione.
Assicurati di controllare il midollo spinale per assicurarti che non rimangano pezzi di meningi. Usa le forcep per separare l'ipotalamo, il cervelletto, il tronco encefalico e la corteccia. Quando necessario, utilizzare pini e forbici per iris e molla per asportare i bulbi olfattivi e il talamo e utilizzare la puntura a doppia punta per rimuovere tutto il plesso coroideo da tutti i ventricoli cerebrali.
Per la dissezione del tessuto del SNC da un grande campione di vertebrato ginesfalico, utilizzare un microscopio sezionante e una puntura a doppia punta, pinza e forbici per iris e molla per rimuovere le meningi da ogni tessuto del SNC, facendo attenzione a rimuovere eventuali pezzi di plesso coroideo dai ventricoli cerebrali. Per l'omogeneizzazione dei tessuti SNC raccolti, tritare ogni regione del SNC in pezzi da uno a due millimetri all'interno delle singole piastre di Petri. Per omogeneizzare i tessuti del SNC da piccoli campioni di vertebrati, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere un millilitro di soluzione MV-1 per sospendere il tessuto tritato.
Quindi utilizzare la stessa pipetta di trasferimento per erogare la corteccia, il cervelletto, lo stelo cerebrale, il lobo ottico e i pezzi del midollo spinale in singole smerigliatrici di tessuto di vetro da 10 millilitri e utilizzare un pestello PTFE e cinque millilitri di soluzione MV-1 per macinare ogni set di tessuti per circa 10 colpi. Trasferire ogni liquame tissutale in singoli tubi conici da 15 millilitri sul ghiaccio e utilizzare le forcelle per posizionare l'ipotalamo e l'ipofisi in 100 microlitri di soluzione MV-1, in singoli tubi da 1,7 millilitri. Quindi, omogeneizzare attentamente ogni tessuto con una micropestle di vetro.
Per omogeneizzare un grande campione di vertebrato, utilizzare una pipetta di trasferimento a taglio smussato per trasferire il tessuto tritato a una smerigliatrice di tessuto di vetro da 55 millilitri e attaccare la smerigliatrice a un agitatore in testa. Aggiungere metà del volume consigliato della soluzione MV-1 in base alla porzione specifica del SNC da omogeneizzare come indicato nella tabella e accendere l'agitatore in testa a circa 150 rotazioni al minuto. Spostare con cura il tubo di vetro su e giù per circa 30 secondi prima di spegnere l'agitatore in testa per aggiungere più soluzione MV-1 per un'omogeneizzazione aggiuntiva, fino a ottenere un liquame omogeneo.
Quindi trasferire il tessuto omogeneizzato in un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Per la purificazione delle microvezze, pellettizzare il tessuto DEL SNC omogeneizzato per centrifugazione e scartare i supernatanti. Per un piccolo campione di vertebrati isolamento microvessel, pipettare la corteccia, il cervelletto, lo stelo cerebrale, il lobo ottico e il pellet del midollo spinale, in cinque millilitri di soluzione MV-2 fresca e ghiacciata per campione, circa 10 volte, prima di aggiungere altri cinque millilitri di soluzione MV-2 ghiacciata ad ogni tubo.
Capovolgere con cura i tubi per mescolare e sospendere di nuovo l'ipotalamo e il pellet ipofisario in un millilitro di soluzione MV-2. Per l'isolamento di microvessel di campioni di vertebrati di grandi dimensioni, aggiungere 20 millilitri di soluzione MV-2 ghiacciata alla corteccia, al cervelletto, allo stelo cerebrale e al pellet di microvessel del midollo spinale e sospendere di nuovo i pellet in un revolver a tubo a 40 rotazioni al minuto per circa 5 minuti. Al termine della nuova sospensione, separare i licate dei tessuti DEL SNC per centrifugazione e ruotare lentamente ogni tubo per consentire al supernatante di passare lungo la parete per staccare con cura lo strato di mielina spesso e denso sull'interfaccia liquida dalle pareti del tubo.
Scartare le interfacce mielina e liquido e asciugare la parete interna di ogni tubo con una spatola avvolta da una salvietta di carta a bassa pelucchi. Quindi, utilizzare una salvietta di carta contorta a bassa pelucchi per assorbire il liquido in eccesso e utilizzare punte a bassa legatura per sospendere di nuovo ogni pellet in un millilitro di soluzione MV-3. Per l'eluizione e la filtrazione di microvessel, mescolare alcuni millilitri di soluzione MV-3 fresca in ogni liquame di microvessel di tessuto CNS e, durante la miscelazione per evitare aggregati, filtrare ogni sospensione attraverso un colino Pruitt in singoli tubi conici da 50 millilitri.
Posizionare un filtro a rete in nylon da 20 micrometri su un supporto filtrante modificato per regione CNS. Trasferire il supporto del filtro su un tubo conico da 50 millilitri e bagnare il filtro con cinque millilitri di soluzione MV-3 ghiacciata, assicurandosi che il tampone si riversi nel supporto del filtro, nel tubo conico. Trasferire le microvezze eluizzate su ogni filtro a rete di nylon da 20 micrometri e sciacquare le microvezze con da cinque a 10 millilitri di soluzione MV-3 ghiacciata.
Utilizzare le forcep per trasferire ogni filtro in singoli becher contenenti la soluzione MV-3 ghiacciata e agitare delicatamente ogni filtro per circa 30 secondi per staccare le microvezze. Dopo il trasferimento in un tubo conico da 15 millilitri, raccogliere le microvezze per centrifugazione e utilizzare una pipetta a bassa legatura per sospendere di nuovo ogni pellet in un millilitro di soluzione MV-3 ghiacciata. Quindi, trasferire le sospensioni di microvessel da piccoli campioni di vertebrati in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri per la centrifugazione per cinque minuti a 20.000 volte G, in quattro gradi celsius.
Per campioni di vertebrati di grandi dimensioni, trasferire la sospensione in singoli tubi di centrifuga a cinque millilitri e aggiungere quattro millilitri di soluzione MV-3 per la centrifugazione per cinque minuti a 2.000 volte G in quattro gradi celsius. I componenti intrinseci dell'unità neurovascolare possono essere rilevati all'interno di microvessi, isolati come dimostrato, mediante immunoetichettatura per CD31, PDGFR-beta e aquaporina quattro, inclusi i microvessi corticali, cerebellari, ipofisi, ipotalamici, cerebrali e spinali. Allo stesso modo, è possibile visualizzare l'espressione della proteina ve-cadherina aderenza, delle proteine di giunzione stretta CLDN5 e Zonula Occludens-1, della proteina di giunzione tricellulare angulin-1 e dei segni basali chemiochina ligando CXCL motivo 12, e gamma-glutamiltransferasi-1.
Inoltre, la maggior parte delle microvessel sono prive dell'espressione dell'actina muscolare liscia alfa, indicando che questo protocollo di isolamento prende di mira selettivamente microvessel di piccolo calibro. Le microvessel ottenute da altri piccoli vertebrati lissencefalici, come uccelli, liard, rane e pesci, condividono alcune caratteristiche morfologiche, suggerendo che questo metodo è utile per un'ulteriore caratterizzazione delle differenze nelle unità neurovascolari tra le specie. La quantificazione dei cambiamenti nell'espressione proteica rivela un aumento della molecola di adesione cellulare vascolare uno, e della molecola di adesione giunzionale B lungo le microvezze del midollo spinale, durante il picco dell'encefalomielite autoimmune sperimentale.
Tuttavia, la molecola di adesione cellulare vascolare uno è anche significativamente aumentato nei microvessi ipofisi, e diminuito nei microvessi ipotalamo e tronco encefalico. Inoltre, si osservano cambiamenti nella molecola di adesione cellulare vascolare un'espressione durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale cronica in tutti i tessuti del SNC e nell'espressione della molecola di adesione congiunzione B nell'ipotalamo e nei microvessi ipofisi. Le analisi quantitative, come western blot, PCR e immunoistochimica, possono essere eseguite seguendo questa procedura per rivelare approfondimenti sui modelli di espressione genica e proteica all'interno della barriera ematico-encefalica.
La paraformaldeide è un reagente acutamente tossico e deve sempre essere maneggiata sotto il cofano dei fumi indossando dPI adeguati.
