Questo lavoro è stato sostenuto dal ministero federale tedesco dell&#39;Istruzione e della ricerca (BMBF), la Systems Biology di segnalazione in Cancro (Helmholtz Alliance on Systems Biology) e il tedesco Cancer Research Center (DKFZ).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali del DKFZ. Attenzione: Al fine di evitare la contaminazione RNAse dei campioni, adottare precauzioni di base per evitare la contaminazione RNAsi e preparare tutti i buffer con acqua trattata con DEPC. 1. Preparazione di saccarosio gradienti <ol><li> Preparare 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 e soluzioni di saccarosio del 50% (cfr. tabella 1). Iniziare a preparare gradienti aggiungendo lentamente 2 ml di soluzione di saccarosio al 50% al fondo di un tubo polyallomer ultracentrifuga. Congelare lo strato posizionando provette per 20 minuti a -80 ° C. </li><li> Aggiungere strati successivi a ridurre le percentuali di saccarosio con passaggi di congelamento in mezzo, finendo al 17,5% di saccarosio. Mantenere pendenze su ghiaccio durante l&#39;aggiunta di soluzioni di saccarosio per evitare lo scongelamento di strati sottostanti. </li><li> Preparare gradienti di saccarosio appena un giorno prima dell&#39;uso e mantenere a 4 ° C. Alternatively, preparare gradienti in anticipo, conservare a -80 ° C e scongelare a 4 ° C la notte prima dell&#39;esperimento. </li></ol> 2. Preparazione Tissue (cavo e / o cerebrale spinale) <ol><li> Anestetizzare il mouse da una dose eccessiva di Xylazin e Ketamin in NaCl e transcardiaca profumato con 20 ml di soluzione di Hank equilibrata di sali (HBSS) contenente 200 CHX mg / ml, che immobilizza i ribosomi su trascrizioni associati. Verificare il corretto anestesia da non-responsività al pizzichi punta. </li><li> Estrarre il tessuto rapidamente. Aprire la dorsale del cranio ed estrarre il cervello. Eseguire laminectomia dell&#39;intero toracica e lombare della colonna vertebrale ed estrarre il midollo spinale. Utilizzare intero cervello (~ 400 mg) o 4 cm pezzo di midollo spinale (~ 90 mg), rispettivamente. </li><li> Trasferire il tessuto in ghiaccio freddo omogeneizzazione tampone A (vedi Tabella 1) (midollo spinale: 1 ml; cervello: 4 ml) e dadi in piccoli pezzi con un bisturi pulito per consentire un maggiore assorbimento di cycloheximide. Perform tutti gli ulteriori passi sul ghiaccio. </li><li> Incubare per 15 minuti e omogeneizzare il tessuto meccanicamente con un omogeneizzatore Dounce. Omogeneizzazione controllato con attenzione è necessaria per garantire che i nuclei rimangono intatti. Trattare tutti i campioni esattamente allo stesso modo per garantire la comparabilità. Nota: per il tessuto cerebrale: Disrupt tessuto da 5 colpi con un pestello tenuta perfetta. Per il tessuto del midollo spinale: distruggere da 5 colpi con un pestello vagamente di montaggio, seguiti da altri 5 colpi con un pestello tenuta perfetta. </li><li> Prendere aliquote (400 microlitri per il cervello e 200 microlitri per il midollo spinale), flash congelare e conservare a -80 ° C per l&#39;isolamento dell&#39;RNA totale. </li><li> Rimuovere nuclei e cellule undisrupted e frammenti di tessuto mediante centrifugazione a 500 xg per 10 min a 4 ° C. Centrifugazione a bassa velocità previene la perdita dei ribosomi. </li><li> Frammenti di membrana Lisare nel surnatante libero nuclei per 30 minuti aggiungendo NP-40 e detergenti sodio desossicolato (ciascuno ad una concentrazione finale di 1%). </li></ol><ol><li> Questo passaggio rimuove componenti grassi dal campione che altrimenti mascherare il segnale nel profilo polyribosome. In primo luogo, pre-raffreddamento secchi ultracentrifuga e rotore a 4 ° C e preparare 2 M, 1.1 M e 0,9 M soluzioni di saccarosio (cfr. tabella 1). </li><li> Mescolare lisato con un 1.22 volumi di soluzione 2 M di saccarosio e trasferire in un tubo di polietilene ultracentrifuga. Riempire tutte le provette a parità di volume di 10 ml con 1,1 M soluzione di saccarosio, successivamente sovrapporre accuratamente con 0,9 M soluzione di saccarosio. </li><li> Posizionare i tubi ultracentrifuga in secchi ultracentrifuga pre-refrigerati. Centrifugare per 3 ore a 100.000 xg a 4 ° C. Durante questo processo ribosomi depositarsi nel pellet che galleggiano componenti grassi e rimangono nel supernatante. </li></ol> 4. Gradiente di saccarosio frazionamento <ol><li> Rimuovere il surnatante e sciogliere pellet in tampone di omogeneizzazione B (vedi Tabella 1 </strong&gt;). Misurare l&#39;assorbanza a 260 nm per ciascun campione utilizzando un Nanodrop o apparecchio equivalente e normalizzare importi da caricare in base al valore di assorbanza. </li><li> Posizionare gradienti di saccarosio (preparazione è descritto in una sezione precedente) nei secchi ultracentrifuga pre-raffreddata. Campioni di livello con attenzione sulla parte superiore del gradiente. Aggiungere un gradiente di saccarosio vuoto come controllo tecnico. </li><li> Regolare il peso di ogni secchio con tampone di omogeneizzazione. Centrifugare i campioni per 1,5 ore a 285.000 xg a 4 ° C. </li><li> Iniziare a preparare Isco frazionatore 30 min prima della fine di centrifugazione. Se si utilizza un altro modello della colonna di frazionamento, seguire il protocollo del produttore. <ol><li> Impostare la sensibilità appropriata (0.2 AUFS per il cervello o 0,05 AUFS per il midollo spinale) per la lampada UV e accenderlo per il riscaldamento. Montare il piercer tubo, collegarlo tramite la pompa a rotazione soluzione di saccarosio del 60% attraverso il piercer tubo. </li><li> Verificare la configurazione pompando saccarosio (il flusso di rattoe: 1 ml / min), in particolare per assicurarsi che non ci sono perdite nei tubi che introdurrà bolle nella sfumatura. </li><li> Background blank assorbimento pompando manualmente tampone gradiente nel rivelatore UV e correzione della linea di base. </li></ol></li><li> Rimuovere con attenzione i secchi ultracentrifuga contenenti i gradienti di saccarosio con campioni sedimentati dal rotore e disporli sul ghiaccio. Evitare qualsiasi urto di gradienti per prevenire la perdita di risoluzione. </li><li> Gradienti Esegui sulla colonna di frazionamento. Eseguire prima di valutare l&#39;assorbimento di fondo e garantire la corretta configurazione tecnica gradienti vuote. <ol><li> Attaccare gradiente al rivelatore UV e perforare il fondo della provetta con il perforatore tubo. Avviare il pompaggio di 60% di saccarosio, che spostare il gradiente con campioni sedimentati verso l&#39;alto attraverso il rivelatore UV e nel dispenser a gocce. </li><li> L&#39;assorbanza a 260 nm è documentato per generare il profilo di assorbimento per il campione, con punte che indicano la sedimentazionezione di mRNA associati alla subunità ribosomiale, monosomes e, successivamente, un numero crescente di ribosomi. </li></ol></li><li> Raccogliere campioni in 20 frazioni tramite il dispenser a gocce (600 ml ciascuna, in 2 ml provette). </li></ol> 5. Isolamento RNA da singole frazioni <ol><li> Aggiungere 10% SDS ad una concentrazione finale di 1% per le singole frazioni e mescolare bene, al fine di spiegare le proteine ​​e dissociare ribosomi. A questo punto i campioni possono essere congelati a -80 ° C. A seconda questione da affrontare, frazioni possono essere raggruppati in base al profilo di assorbanza. </li><li> Isolare RNA con estrazione fenolo / cloroformio acida, che rimuove anche contaminanti tracce di DNA. <ol><li> Aggiungere un volume di acido fenolo / cloroformio (preriscaldata a RT) per ogni campione, calore per 10 min a 65 ° C e pressione di rilascio sotto la cappa dopo. </li><li> Centrifugare i campioni per 20 minuti a 17.000 xg a temperatura ambiente. Trasferire accuratamente fase acquosa a un nuovo 1,5 mltubo. Siate consapevoli di inversione di fase in dense frazioni saccarosio, in cui la fase acquosa potrebbe essere in fondo dopo la centrifugazione. </li><li> Aggiungere un volume di isopropanolo, 1/9 volumi di acetato di sodio (pH 5,2) e 1 ml GlycoBlue a ciascun campione allo scopo di precipitare l&#39;RNA. I campioni di almeno 1 ora a -80 ° C. </li><li> Centrifugare per 30 minuti a 17.000 xg e 4 ° C. GlycoBlue fornisce una visualizzazione del pellet. Rimuovere il surnatante, lavare pellet una volta con ghiaccio freddo 80% di etanolo e pellet aria secca. Sciogliere pellet in RNAsi acqua libera. </li></ol></li><li> Quantificare quantità di RNA da Nanodrop e analizzare l&#39;integrità dell&#39;RNA da un chip Bioanalyzer. RNA che viene ottenuta con il protocollo presentato è adatto per tutti stato dell&#39;arte saggi high throughput compresi microarray e sequenziamento. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Sebbene polyribosome frazionamento non è una tecnica innovativa, rimane particolarmente impegnativo. Sulla base del materiale in ingresso, sostanziale ottimizzazione può essere necessario. Questo è soprattutto il caso di campioni in vivo del sistema nervoso centrale, in cui la quantità di materiale è spesso un limite e grassi componenti del tessuto ostacolano l&#39;isolamento di mRNA traduzione. Protocolli di frazionamento maggior parte pubblicati trattano lievito o linee cellulari di mammifero, e ci sono protocolli stabiliti per il cervello 12,13,14. Al contrario, ci sono a malapena eventuali pubblicazioni che descrivono frazionamento del midollo spinale, e precedenti protocolli richiedono midollo spinale da un gran numero di animali da pool 15. Per queste ragioni, sono state apportate diverse modifiche necessarie per adattare il protocollo di frazionamento per tessuti SNC, inclusa singolo mouse midollo spinale. Immobilizzazione ribosoma con cycloheximide viene eseguita durante la perfusione degli animali al fine di evitare la dissociazione dei ribosomi During il lungo processo di estrazione del tessuto. Successivamente, RNA polisomi vengono estratti in modo specifico per massimizzare la resa polyribosome. Primo, controllata omogeneizzazione del tessuto da douncing, mantiene il nucleo intatto e previene la contaminazione del DNA. Il nucleo viene quindi rimosso in modo affidabile mediante centrifugazione. La combinazione dei detergenti NP-40 e sodio desossicolato assicura lisi del reticolo endoplasmatico e rilascio dei suoi ribosomi membrana associata. Inoltre, i componenti di assorbimento UV all&#39;interno del ricco mielina lipidi oscurano i profili polyribosome. La mielina flottazione è quindi necessario, dove i composti densi come poliribosomi sono pellet e composti leggeri, come mielina galleggiante e vengono rimossi 16. Poliribosomi vengono sedimentate su un gradiente di saccarosio 17,5% al ​​50%. Invece di stratificazione manualmente e congela ogni strato saccarosio, gradienti possono anche essere preparati utilizzando un mixer gradiente. Estrazione di RNA da frazioni utilizzando acido fenolo / cloroformio permette DNA essere rimosso con una minima perdita di RNA. Tuttavia, inversione di fase può verificarsi in frazioni di saccarosio dense (sopra frazione 16). Questo protocollo fornisce vantaggi rispetto ad altri metodi convenzionali che affrontano il livello di traduzione. Ad esempio, sia la misura di S6 fosforilata (un marcatore traduzione prominente) e etichettatura di catene nascenti con radioisotopi forniscono informazioni sui livelli di traduzione globali ma rivelano poco su quale importo viene tradotto. Polyribosome frazionamento, invece, permette non solo la valutazione della traduzione globale, ma anche l&#39;identità di mRNA traduzione e le relative proteine ​​regolatrici. Real time PCR può essere eseguita su RNA isolato per una rapida lettura su mRNA selezionate e microarray e sequenziamento di prossima generazione RNA può essere eseguita per studi genome wide. Le ottimizzazioni qui presentati permettono la tecnica per essere utilizzato con minime quantità di tessuto cerebrale, quindi diminuiscezione il numero di animali necessari e migliorare la qualità sperimentale complessivo riducendo il tempo di lavorazione del tessuto. D&#39;altra parte, questa tecnica non può distinguere ribosomi in stallo da quelle traduzione. Trascrizioni che trasportano ribosomi stallo si sedimenta in frazioni pesanti, e questo dovrebbe essere tenuto presente quando si interpretano i dati. Ci sono recenti tecniche riportate, vale a dire RiboTaq e TRAP, in cui ribosomi sono etichettati con tag o giornalisti epitopi rispettivamente in modo specifico tipo di cellula e mRNA isolati mediante immunoprecipitazione 17,18 associati. Questa tecnica può essere accoppiato a polyribosome frazionamento di offrire alta risoluzione leggere per specifiche popolazioni cellulari. Ribosoma piede-stampa è un&#39;altra tecnica innovativa che coinvolge nucleasi digestione per generare piccoli frammenti, o &quot;impronte&quot;, di mRNA che sono protetti dai ribosomi. Le biblioteche sono poi generati da queste impronte e sequenziati. Questo metodo provIDES tutta l&#39;analisi del genoma specifico codone sulla traduzione ed è in grado di identificare i ribosomi fase di stallo, non-agosto avviare codoni e piccoli a monte di lettura aperta, che non possono essere raggiunti da polyribosome frazionamento 19. Tuttavia, polyribosome frazionamento può essere accoppiato a profilatura ribosoma per l&#39;isolamento di frammenti digeriti contenenti singoli ribosomi, arricchendo così le specie molecolari necessari per la preparazione raccolta in cui è spesso richiesta un&#39;elevata purezza del campione. Presi insieme, polyribosome frazionamento è un metodo flessibile con importanza durevole e può essere accoppiato a varie applicazioni a valle, compresi ampi saggi genoma come sequenziamento di prossima generazione.

L&#39;espressione genica è determinata dall&#39;azione combinata di trascrizione, traduzione e stabilità di mRNA e proteine, con traduzione recanti l&#39;effetto più predominante 1. E &#39;ormai evidente che ognuno di questi passi è altamente regolamentato. Micro-RNA, formazione di granuli di RNA, alternativa e poliadenilazione citoplasmatica alcuni esempi di regolazione post-trascrizionale dell&#39;espressione genica 2,3. Ciascuno di questi meccanismi disaccoppia trascrizione da traduzione e influenza il proteoma nel sistema biologico di interesse. Così, ovviamente, i livelli di mRNA da soli sono una lettura imperfetta dei livelli della proteina 4. Proteomica quantitativa fornisce la valutazione più diretta dell&#39;espressione genica, ma nonostante i recenti progressi, vi sono ancora notevoli limitazioni sulla sensibilità e risoluzione sequenza proteica. Affrontando quindi il translatome, il repertorio di mRNA traduzione, offre un ottimo compromesso tra lo studio dellatrascrittoma e proteoma. E &#39;più preciso di trascrittomica nella valutazione dell&#39;espressione genica finale, e fornisce sia una maggiore copertura e una risoluzione sequenza di proteomica. Nei mammiferi, la maggior parte degli eventi di traduzione inizia con apertura cap-dipendente. Un gruppo di fattori di inizio eucariotiche insieme alla subunità ribosomiale 40S piccola assemblare al tappo 5 &#39;di un mRNA. Il complesso poi esegue la scansione del mRNA e al raggiungimento del codone di inizio agosto, recluta la subunità ribosomiale 60S grande per formare un completo 80S dei ribosomi. Il ricavato della fase di allungamento con il ribosoma si muove lungo l&#39;mRNA, con fattori di allungamento assistere l&#39;incorporazione di aminoacidi da tRNA caricati alla catena peptidica nascente. Diverse ribosomi possono procedere lungo un singolo mRNA simultaneamente e il numero di ribosomi associato è stato dimostrato essere correlato con il tasso di sintesi proteica 5,6. Questo rende ribosomiale carico un&#39;indicazione affidabile per translation e permette la separazione di tradurre attivamente mRNA basato su tasso di sedimentazione. Oltre alla quantificazione di tradurre mRNA, informazioni di sequenza può essere ottenuta per identificare motivi coinvolti nella regolazione traduzione. RNA anche proteine ​​leganti ed altri fattori di traduzione possono essere isolati da differenti frazioni, facilitando lo studio e la scoperta di proteine ​​regolatrici correlate. Nel sistema nervoso, controllo traduzionale è stato collegato a processi quali mRNA stoccaggio, trasporto e sintesi proteica locale. Coni di crescita hanno dimostrato di ospitare una determinata piscina localizzata di mRNA distinte dal resto dell&#39;assone 7. Inoltre, assoni possiedono la capacità di sintetizzare localmente proteine ​​8,9. Come risultato, il controllo locale della traduzione è diventato un tema cruciale di studio in neurobiologia. Il potenziale di polyribosome frazionamento per affrontare questo è stato illustrato in diversi studi, in cui la tecnica è stata utilizzata perindagare guida degli assoni nello sviluppo del midollo spinale, e dimostrato la definizione attività-dipendente di BDNF nel cervello 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Più processi sono coinvolti nell&#39;espressione genica tra cui trascrizione, traduzione e stabilità di mRNA e proteine. Ognuno di questi passaggi sono strettamente regolati, influenzando le dinamiche finali di proteine ​​abbondanza. Esistono vari meccanismi di regolazione nella fase di traduzione, rendendo livelli di mRNA solo un indice affidabile della espressione genica. Inoltre, la regolazione locale della traduzione dell&#39;mRNA è stata particolarmente coinvolta nelle funzioni neuronali, spostando «translatomics &#39;al centro dell&#39;attenzione in neurobiologia. Il metodo proposto consente di trascrittomica ponte e proteomica. Qui descriviamo modifiche essenziali alla tecnica di polyribosome frazionamento, che interroga il translatome basato sull&#39;associazione di mRNA tradotte attivamente a più ribosomi e la loro sedimentazione differenziale gradienti di saccarosio. Tradizionalmente, lavorando con campioni in vivo, in particolare del central sistema nervoso (CNS), si è dimostrato impegnativo a causa della quantità limitate di materiale e la presenza di componenti di tessuto adiposo. Per risolvere questo problema, il protocollo descritto è specificamente ottimizzato per l&#39;uso con minima quantità di materiale CNS, come dimostra l&#39;uso di singolo mouse midollo spinale e cervello. In breve, i tessuti del sistema nervoso centrale vengono estratte e ribosomi traduzione sono immobilizzati su mRNA con cycloheximide. Mielina flottazione viene poi eseguita per rimuovere ricchi componenti lipidici. Frazionamento viene eseguita su un gradiente di saccarosio, laddove mRNA sono separati in base alla loro ribosomiale carico. Isolato frazioni sono adatti per una vasta gamma di test a valle, comprese le nuove tecnologie di analisi del genoma di larghezza.

La figura 2 mostra i profili polyribosome rappresentativi dopo frazionamento. I profili del cervello e del midollo spinale mostrano curve caratteristiche di assorbimento come descritto prima per linee cellulari. mRNA legati alle piccole subunità ribosomiale (40S) sedimenti in frazioni più leggere ed appaiono prima come picco sul profilo, seguita dalla subunità ribosomiale (60S) e monosome (80S) mRNA legati. mRNA legati a più ribosomi sedimentare in frazioni più pesanti, con i picchi successivi indicano un numero crescente di ribosomi associati. Traduzione globale può essere valutata dal profilo. Come esempio, tessuto cerebrale ha una polyribosome superiore a monosome rapporto di tessuto del midollo spinale, che indica più traduzione attiva. RNA estratto da singole frazioni sono stati valutati da Bioanalyzer, mostrando la distribuzione di 18S e 28S rRNA. 18S rRNA precedenza appare nel profilo, in conformità con le piccole subunità ribosomali sedimenta in sucr leggero<html> frazioni OSE. Le rese di RNA totale sono 10-20 mg per cervello e 2-4 mg per midollo spinale. Rendimenti RNA da singole frazioni sono fino a 4 mg e 0,8 mg per il cervello e il midollo spinale, rispettivamente, a seconda della frazione. Un gradiente di saccarosio vuoto contiene già alcune assorbimento sfondo a 260 nm, per la presenza di DTT. Questo sfondo può essere sottratto durante l&#39;analisi dei dati al fine di normalizzare i valori dei campioni. Trattamento EDTA crollato picchi polyribosome, dimostrando il profilo di sedimentazione è dovuta alla traduzione. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Workflow e potenziali applicazioni di in vivo polyribosome frazionamento.&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Profili di Figura 2. (A) profili polyribosome tipici di cervello e midollo spinale, con la valutazione di RNA estratto da Bioanalyzer. (B) Distribuzione di GAPDH mRNA oltre frazioni di qRT-PCR. (C) Polyribosome di gradiente vuota e cervello con e senza trattamento EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> Buffer di gradiente 2x </td><td> 30 mM Tris-HCl pH7.4, 30 mM MgCl 2, 600 mM NaCl, 200 mg / ml cicloesimide (CHX), 2 mM ditiotreitolo (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> soluzione di saccarosio 17,5% </td><td> 8.67 g di saccarosio, 25 ml 2x tampone gradiente, fino a 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> soluzione di saccarosio 25,6% </td><td> 12,8 g di saccarosio, 25 ml 2x tampone gradiente, fino a 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> soluzione di saccarosio 33,8% </td><td> 16,9 g di saccarosio, 25 ml 2x tampone gradiente, fino a 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> soluzione di saccarosio 41,9% </td><td> 20,95 g di saccarosio, 25 ml 2x tampone gradiente, fino a 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> soluzione di saccarosio al 50% </td><td> 25 g di saccarosio, 25 ml 2x tampone gradiente, fino a 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> omogeneizzazionetampone A </td><td> 0,25 M saccarosio, 50 mM Tris / HCl, pH7.4), 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 200 ug / ml CHX, inibitore della proteasi completo 1x Roche, DTT 1 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1mM (PMSF), 100 U / ml RNasin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> Soluzione di saccarosio 2M </td><td> 68,4% di saccarosio, 50 mM Tris-HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inibitore della proteasi completo 1x Roche, 1 mM DTT, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M soluzione di saccarosio </td><td> 38,5% di saccarosio, 50 mM Tris-HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inibitore della proteasi completo 1x Roche, 1 mM DTT, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M soluzione di saccarosio </td><td> 30,8% di saccarosio, 50 mM Tris-HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inibitore della proteasi completo 1x Roche, 1 mM DTT, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization tampone B </td><td> 0,25 M saccarosio, 50 mM Tris / HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1% NP-40, 1% sodio desossicolato </td><td> 200 ug / ml CHX, inibitore 1x Roche completo proteasi, 1mM DTT, 1 mM PMSF, 100 U / ml RNasin </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco dei tamponi e soluzioni.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Questo protocollo illustra le modifiche essenziali della polyribosome frazionamento, al fine di studiare la translatome di vivo campioni SNC in. Permette valutazione globale della regolamentazione traduzione e trascrizione attraverso l&#39;isolamento e il confronto di RNA totale di ribosoma frazioni di RNA legati.

In vivo Interrogatorio del Sistema Nervoso Centrale Translatome da Polyribosome Frazionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K Views.  German Cancer Research Center (DKFZ).  Questo protocollo illustra le modifiche essenziali della polyribosome frazionamento, al fine di studiare la translatome di vivo campioni SNC in. Permette valutazione globale della regolamentazione traduzione e trascrizione attraverso l'isolamento e il confronto di RNA totale di ribosoma frazioni di RNA legati. 

Video: In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Resezione del nervo ottico: un modello di apoptosi Neuron adulti nel Sistema Nervoso Centrale

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Ricerca

Neuroscienze

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Valutazione funzionale di neurotossine biologiche in Culture in rete di cellule staminali derivate dal Sistema Nervoso Centrale Neuroni

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...