Ringraziamo Ann Mei Lim per la lettura critica del manoscritto e di altri membri del nostro laboratorio per le loro discussioni in tutto il corso di questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato dalla Yamada Science Foundation e la Royal Society Borse Visita brevi e UE Marie Curie International Fellowship GRR arrivo per KK, e BBSRC Progetto Grant (BB/H002278/1) e Wellcome Trust attrezzature Grant (073228/Z/03/Z) a AH

1. Raccolta di Staged larve <ol><li> Place 15 femmine e 15 maschi adulti mosche in una gabbia cilindrica perspex per deporre le uova su una piastra di Petri con agar e succo d&#39;uva integrato con una piccola paletta di lievito in pasta per 3 ore a 25 ° C. Modificare la piastra 3-4 volte al giorno, e scartare la prima piastra (cioè da O / N uovo-laico). Eliminare anche le piastre dal primo giorno. Dal secondo giorno in poi, mantenere le piastre con le uova a 25 ° C. Dopo 7 giorni di raccolta di uova, iniziare con una nuova messa a punto di mosche padre. </li><li> Dopo circa 24 ore, larve si schiudono dalle uova. Agganciando larve con un pennello o diluito con un paio di pinze, trasferire 35 larve dalla agar uve ad un flacone contenente cibo standard fly (10 ml) (Figura 1A). </li><li> Mantenere le fiale contenenti larve per 3 giorni (96 ore dopo la posa Egg, AEL) a 25 ° C. </li></ol> 2. Dissezione di larvali cordoni nervosi ventrali per la cultura <ol><li> Pulire esserench e le mani con il 70% di etanolo. Mettere a bagno 4 blocchi di colorazione, 2 paia di pinze e un ago con il 70% di etanolo, e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Preparare 4 blocchi di colorazione i seguenti supporti: uno con acqua distillata (DW) per la pulizia e per le larve piscina pulita, un secondo con 2 ml di Shield e Sang medie M3 insetto con 1% di penicillina e streptomicina, ecdisone-free (M3 PS media) per sezionare le larve, un terzo con 2 ml di terreno M3 PS piscina sezionati cordoni nervosi ventrali (VNCs), ed un quarto con 2 ml di terreno M3 PS per pugnalare i VNCs. Tutti i reagenti devono essere pre-riscaldato a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere acqua nel flacone contenente 96 ore larve AEL. Quindi, utilizzando una spatola, delicatamente diffuso alimentare con larve dal flacone su un tovagliolo di carta bagnata. Trasferire 10 larve di un blocco contenente colorazione DW per lavare via il cibo. Sostituire DW 6 volte. Quindi sostituire con mezzo M3 PS. </li><li> Trasferire una delle larve di un blocco colorazione contenente 2 ml di terreno M3 PS. </li><li> Sotto un microscopio per dissezione, dissect un cervello larvale accuratamente utilizzando metodi standard 12, ma per ridurre al minimo i danni ai tessuti, particolare cura procedendo nel modo seguente. Posizionare il lato dorsale larva, e tenere premuto il lato dorsale a un terzo dalla fine anteriore con 2 coppie di pinze (una in ogni mano). Pur tenendo la parte anteriore, tirare via l&#39;estremità posteriore con le pinze, e strappare l&#39;epidermide. Il cervello e il VNC deve essere visibile dal bordo posteriore della metà anteriore. Attenzione isolare il cervello e complesso VNC rimuovendo il grasso corporeo, l&#39;intestino e l&#39;epidermide. Quando i VNCs sono danneggiati troppo, i VNCs degenererà in tutto o in parte, anche senza lesioni accoltellamento. Prendere in considerazione i seguenti punti: </li></ol><ul><li> Non tirare o strappare i dischi immaginali e dei nervi periferici del torace VNC per non danneggiare il VNC. Per tagliare i nervi periferici, tenere i nervi periferici con due coppie di pinze poste vicino l&#39;un l&#39;altro, e poi tirare i nervi con la perporcini. Dischi immaginale e parti della bocca possono essere lasciati attaccati al VNC. </li><li> Lasciare la ghiandola anello e ghiandola linfatica collegato al cervello. </li><li> Tagliare il budello nel punto più vicino al cervello, dove è contenuto il cibo non molto. </li></ul><ol start="6"><li> Utilizzando un P20 Pipetman con la punta tagliata e allargato un po &#39;, trasferire il VNC ad un blocco contenente colorazione fresca M3 media PS. Prima di trasferire l&#39;, VNC prima pipetta su e giù solo il mezzo utilizzato per la dissezione, per evitare l&#39;VNC di attaccarsi alla punta. </li></ol> 3. Stabbing Infortunio alla larvale Drosophila VNC Questa sezione descrive come eseguire lesioni pugnalare alle VNCs, e di preparare accoltellati-VNCs per time-lapse di analisi e immunostaining. Post-lancinanti condizioni di coltura e la durata sono descritte nella sezione 5 (per time-lapse analisi) e nella sezione 6 (per immunostaining). <ol><li> Dopo la messa in comune VNCs abbastanza (4-5 per time-lapsee più di 24 per immunostaining), trasferisce un VNC ad un blocco colorazione pulita contenente M3 PS. </li><li> Orientare il VNC in modo che il neuropile dorsale è tenuto sotto il microscopio da dissezione (Figura 1B). Questo è l&#39;orientamento più naturale per VNCs a mentire se collegato ai lobi ottici. </li><li> Stab manualmente usando un ago di tungsteno sotto il microscopio dissezione, dal lato dorsale pressoché ad angolo retto e puntando il mezzo addominale del VNC (Figura 1B). </li></ol> Prestare particolare attenzione per quanto segue: <ul><li> Stab sola volta. </li><li> Stab finché l&#39;ago urta il fondo del bicchiere. Tuttavia, fare attenzione a non danneggiare la punta dell&#39;ago. </li><li> Lo stelo del supporto dell&#39;ago non deve toccare il terreno durante la lancinante. </li><li> La ferita non è visibile al microscopio dissezione. </li></ul> Nota: Stab-infortunio degenerazione indipendente La procedurapuò portare a degenerazione cellulare nel VNC distinto dalla lesione coltellate. Risultati degenerazione buchi nel neuropile, e, occasionalmente, i fori sono stati osservati nella corteccia di esemplari non accoltellati. I campioni con degenerazione colpisce la degenerazione neuropile o diffusa che colpisce anche la superficie VNC deve essere scartato. Degenerazione possono essere identificati come segue: <ul><li> Superficie ruvida, specialmente al laterale / zona ventrale del torace, a 22 ore di coltellate. In casi estremi, il VNC sembra sporgente. </li><li> Fori o vacuoli nel neuropile toracica, che può essere visibile come fori segnale di fondo con immunocolorazione fluorescenza. </li></ul> 4. Manutenzione di Ago e Pinze <ul><li> Controllare periodicamente se la punta dell&#39;ago è abbastanza affilato. La punta dell&#39;ago può essere piegato o spuntato dopo averlo usato per diversi esperimenti. In questo caso, affilare la punta con una pietra Arkansas o equivalente. </li><li> Le punte della pinza devonoincontrano perfettamente. Le punte possono essere danneggiati con l&#39;uso. In questo caso, regolare la punta con un pietre Arkansas o equivalente. </li></ul> 5. Cultura e registrazione time-lapse di VNCs accoltellato Per visualizzare il neuropile assonale nel VNC vivente, una linea di proteina GFP trappola che etichetta tutti gli assoni - G9 13 - possono essere utilizzati, e di visualizzare tutte le cellule gliali (tranne la glia linea mediana) il driver gliale repoGAL4 può essere utilizzato per esprimere il UASdsRed S197Y 14 reporter. Attraversando G9 vola UASdsRedS197Y;, repoGAL4 mosche, VNCs da larve progenie si ottengono con assoni e glia verde rosso che possono essere registrate nei tessuti viventi. <ol><li> Dopo pooling VNCs 4-5, trasferire 1 VNC ad un blocco colorazione pulito contenente 2 ml di M3 PS, e colpire la parte addominale del VNC, come indicato nella sezione 3. </li><li> Trasferire il accoltellato VNC ad una poli-L-lisina rivestito 3,5 mm di vetro piatto fondo Petri contenente 1 ml di M3PS. Posizionare il lato VNCs dorsale verso il basso. Spingere delicatamente il VNC con la parte piatta di un paio di pinze per consentire al VNC di aderire al piatto. </li><li> Delicatamente aggiungere 1 ml di M3 PS 15% FBS rendere la concentrazione finale di 7,5% di FBS. </li><li> Acquisire immagini con scansione laser microscopia confocale. Eseguire la scansione del VNC, la raccolta di una Z-sezione della serie in tutto lo spessore. Abbiamo usato un microscopio invertito Leica SP2 confocale con una camera a temperatura controllata ambientale. Ogni microscopio confocale equivalente dovrebbe funzionare, ma può richiedere l&#39;ottimizzazione delle impostazioni per la scansione. Le impostazioni per il nostro tempo-lapse microscopia confocale sono stati i seguenti: temperatura della camera ambientale: 25 ° C; 20X obiettivo con zoom 4 volte; modalità di scansione xyzt, con risoluzione 512x512 pixel, z = passi di 1 micron e di 1 ora o 2 - intervalli di un&#39;ora. </li></ol><ul><li> Il microscopio confocale Leica SP2 ha un limite di dimensione del file per la scansione. Con queste impostazioni, 8-9 tempi di valutazione può essere acquisita. Conaltri microscopi confocale, dovrebbe essere possibile acquisire serie di immagini per i punti di tempo più lunghi, vale a dire nell&#39;arco di un massimo di 24 ore. </li></ul> 6. Cultura e immunocolorazione di VNCs accoltellato e fisso <ol><li> Preparare un 24 pozzetti piastra di coltura tissutale contenente 500 ml di M3 PS 7,5% FBS per pozzetto. </li><li> Ripetere la dissezione di più di 24 VNCs per un piatto di 24 pozzetti di coltura. </li><li> Usando il P20 Pipetman con la punta cut-off, di trasferimento 12 VNCs non pugnalato dalla piscina al piatto di coltura, utilizzando 1 VNC per pozzetto. </li><li> Stab il resto VNCs in piscina, come descritto nella sezione 3. Trasferire ogni accoltellato VNC per un pozzo ciascuno. </li><li> Posizionare il piatto a 24 pozzetti in incubatore a 25 ° C per una durata desiderata a seconda dell&#39;esperimento. Integrità cellulare è inalterato per almeno 24 ore. </li><li> Dopo la cultura, trasferire i 12 VNCs in 250 microlitri della PEM formaldeide al 4% in una provetta 1,5 ml utilizzando il P20 Pipetman con la punta cut-off. Poi, il fixative è attentamente pipettato fuori, facendo attenzione a non danneggiare le VNCs. Una piccola quantità di fissativo sufficiente a coprire i campioni dovrebbero rimanere in ogni provetta. Successivamente, aggiungere fissativo fresco, e agitare delicatamente per 50 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare due volte con 0,3% Triton X PBS, e quindi lavare due volte per 10 minuti con 0,3% Triton X PBS a RT. </li><li> VNCs blocco di incubazione con 10% siero di capra normale in 0,3% Triton X PBS per 1 ora a RT. I campioni possono essere conservati a 4 ° C per almeno un mese. </li><li> Incubare VNCs con anticorpi primari per più di 20 ore a 4 ° C. </li><li> Risciacquare due volte con 0,3% Triton X PBS, poi lavare 3 volte per 10 minuti con 0,3% Triton X PBS a RT. </li><li> Incubare VNCs con anticorpi secondari per più di 16 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare 2 volte con 0.3% Triton X PBS, poi lavare 3 volte per 10 min con 0.3% Triton X PBS a temperatura ambiente RT (al buio se si utilizza anticorpi secondari fluorescenti). </li><li> Sostituire PBS con glicerolo al 50%: 50% PBS per almeno unore. </li><li> Quindi sostituire con glicerolo 80%: 20% PBS per almeno un&#39;ora. </li><li> Montare un VNC in una finestra realizzata su 2 strati di violoncello-tape (circa 0,06 mm) su una lastra di vetro microscopio. Regolare l&#39;orientamento, e mettere un coprioggetto (18x18 mm) sopra la finestra. Due VNCs può essere montato su una slitta con questo metodo. </li></ol> Utilizzando una varietà di anticorpi primari, diverse risposte cellulari al danno può essere analizzato (ad esempio modifiche del numero di cellulare e la forma delle cellule). 7. Analizzare i dati utilizzando ImageJ e una serie di Plugin Se il VNC non ha accoltellato degenerazione indipendenti, il campione deve essere calcolato in per l&#39;analisi a prescindere dalle dimensioni della lesione. Come lancinante avviene manualmente, la dimensione della lesione varia ogni volta. Quindi è importante analizzare statisticamente l&#39;effetto di coltellate, quando possibile. <ol><li> Ferita misura delle dimensioni. La dimensione della ferita è un indicatore di riparazione 15.La lesione accoltellamento è visibile in quanto priva di espressione GFP. Zona della lesione può essere misurato utilizzando dati lapse disponibile gratuitamente il software ImageJ, come segue: <ol><li> Utilizzando ImageJ, aprire una pila di immagini confocali dal menu &quot;File&quot;, selezionare &quot;Importa&quot; e da qui selezionare &quot;sequenza di immagini&quot;. Questo accende la raccolta di singole immagini in una pila. </li><li> Avanti cambiare la &quot;pila&quot; in un &quot;HyperStack&quot; andando al menu &quot;Image&quot;, selezionare &quot;HyperStack&quot;, quindi selezionare &quot;Pila a HyperStack&quot;. </li><li> Impostare la dimensione voxel utilizzando &quot;Proprietà&quot; dal menu &quot;Immagine&quot;. In dati acquisiti utilizzando il microscopio confocale Leica SP2, la dimensione voxel può essere ottenuta dalla scansione-software, e dal file di testo metadati salvati insieme alle immagini. Con la nostra impostazione come descritto nella Sezione 3, le dimensioni in pixel sono xy = 0,366211 micron e z = 0,99709 micron. </li><li> Esaminando tutte le fette in un punto di tempo, disegnare il contorno della zona di massima lesione con il poligono strumento di selezione nella barra degli strumenti. Questo è l&#39;Regione di interesse (ROI). </li><li> Aggiungere il ROI al gestore ROI andando al menu &quot;Analizza&quot;, scorrere verso il basso e selezionare &quot;Strumenti&quot;, quindi &quot;manager ROI&quot;, poi &quot;add&quot;. </li><li> Ripetere questa procedura per i tutti i punti temporali. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Misura&quot; nel gestore di ROI per ottenere la dimensione area di ogni ROI. </li></ol></li><li> Correzione del movimento VNC durante registrazioni time-lapse. &quot;Stackreg&quot; e &quot;Turboreg&quot; plugin 16 (dal sito ImageJ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ): questi plugin permettono di correggere movimenti campioni di piccole durante il time-lapse. Costruire una pila con un equivalente sezione rappresentativa ottica attraverso tutti i punti temporali e applicare i plug-in. Essa aiuta a visualizzare come cambia lesione nel tempo. I dettagli su questi metodi e il manuale di istruzioni sono disponibili presso il gruppo di ricerca che ha sviluppato questi plugin. ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/" target="_blank">http://bigwww.epfl.c</a>h / Thevenaz / stackreg /). </li><li> Conteggio automatico di cellule gliali. &quot;DeadEasy glia&quot; plugin ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a> ): questo è stato progettato per contare il numero di cellule gliali REPO-positivi nel larvale Drosophila VNC e di esaminare la variazione gliale numero di coltellate causati da lesioni 17. Il plug-in funziona con precisione, con un errore di 0,1% di falsi positivi e falsi negativi 4,3% 17. Per utilizzare questo plug-in, prima etichetta tutta la glia (tranne la linea mediana) nel campione mediante immunofluorescenza con anticorpi anti-REPO. Quindi installare il plug-in in ImageJ, aprire una pila di immagini confocale ed eseguire plug-in. Conta cellule gliali automaticamente in circa 30 secondi. </li><li> Conteggio automatico di cellule apoptotiche. &quot;Larve caspasi DeadEasy&quot; plug-in ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.bioscienc</a>es-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Questo è stato sviluppato per contare il numero di cellule marcate con anti-spaccati-Caspase3, e una nuova versione è stata adattata per i VNCs larvali. Lancinante lesione provoca un aumento della morte cellulare programmata 11. Per utilizzare questo plug-in, le cellule apoptotiche prima etichetta del campione con immunofluorescenza con anti-spaccati-caspasi-3 anticorpi. Quindi installare il plug-in in ImageJ, aprire una pila di immagini confocale ed eseguire plug-in. Conta cellule apoptotiche automaticamente in circa 30 secondi. </li></ol> 8. Reagenti <ol><li> Cultura media: Shield e Sang medie insetti M3, 7,5% di siero fetale bovino, 1% e l&#39;1% penicillina streptomicina. </li><li> 0,01% Poly-L-lisina in sterile DW. </li><li> Fissativo: 4% di formaldeide, ultra pura PEM (0.1 TUBI M, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4) soluzione. </li><li> Soluzione bloccante per immunostaining: 10% di siero di capra normale in 0,3% Triton X PBS. </li><li> Anti-glutammina sintetasi2 anticorpi: 1:250 in soluzione di blocco. </li><li> Anti-GFP anticorpi: 1/1.000 a bloccare soluzione. </li><li> Anticorpi anti-REPO: 1:250 in soluzione di blocco. </li><li> Anti-ELAV anticorpi: 1:250 in soluzione di blocco. </li><li> Anti-spaccati caspasi 3 anticorpi: 1/1.000 a bloccare soluzione. </li><li> Anticorpi secondari: 1:250 in soluzione di blocco. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo stabilito un protocollo per accoltellamento lesioni al sistema nervoso centrale larvali di Drosophila di indagare le risposte cellulari al danno, la riparazione e la rigenerazione. VNCs larvali sono sezionati e accoltellato, dopo di che sono realizzati con il time-lapse microscopia o fissato per immunostaining fluorescenza di visualizzare glia e neuroni, l&#39;apoptosi o la divisione cellulare. La progressione della lesione nel tempo può essere misurato. Questo metodo è accompagnato da un software appositamente sviluppato per l&#39;analisi quantitativa e statistica del numero cambia cellulare dopo lesioni e durante la riparazione. Abbiamo pugnalato 96 ore larve AEL (e questi sono stati fissa o permesso di sviluppare ulteriormente), una fase di sviluppo prima del passaggio alla pupa e poi mosca adulta. A 96 ore, VNCs sono abbastanza grandi per accoltellamento, sono nel mezzo del terzo stadio instar, e quindi non sono sottoposti pupation ancora, e il sistema nervoso è già pienamente funzionale simile a quella dell&#39;annuncioUlt. Potrebbe essere possibile per pugnalare un po &#39;più avanti in larve e la tempistica precisa deve essere scelto in funzione della domanda di ricerca. Tuttavia, a seconda delle questioni affrontate, sarà generalmente necessario per coltivare le VNCs per qualche tempo per osservare le risposte cellulari al danno. Qualche tempo dopo 120 ore inizio ninfosi AEL, un periodo in cui il sistema nervoso centrale è ristrutturato ed è quindi meglio evitare. Così la finestra temporale per aver accoltellato la cultura più nella larva è piuttosto limitato. Usando una larva ha ancora un grande vantaggio tecnico rispetto all&#39;utilizzo di adulti: mentre, allo stesso modo per l&#39;adulto, il sistema nervoso è già perfettamente funzionante, analizzando la risposta al danno è molto più facile e più veloce in larve. Quando si confrontano le dimensioni e la morfologia del cervello e VNCs sezionati e coltivate in un piatto di VNCs che sono sezionate in un punto equivalente momento senza coltura in un piatto, sembra che lo sviluppo è più lento in coltura che in vivo. Sotto altri aspetti,sviluppo svolge normalmente in coltura, l&#39;integrità dei tessuti viene conservato e le cellule sono vive mostrando risposte multiple. Espansione della ferita, la riparazione e la proliferazione gliale neuropile avvenire entro 22 ore post-accoltellamento. Questo dimostra che le risposte cellulari ad lesioni avvengono nella cultura e probabilmente esiste alcuna necessità di mantenere gli espianti per più di un giorno. Se la cultura a più lungo termine sono stati desiderati, il protocollo può richiedere un&#39;ulteriore ottimizzazione come l&#39;utilizzo di un inserto piastra di coltura 5. È importante identificare i campioni di buona qualità da quelli degenerazione. Ottimizzazione questo protocollo richiede un po &#39;di abilità e, inevitabilmente, la degenerazione si verifica in alcuni esemplari. Il VNC può acquisire un aspetto &#39;cavolfiore&#39; che riflette una ripartizione di integrità dei tessuti (Figura 5B). Degenerazione è riconosciuto anche dalla vacuolizzazione del VNC indipendentemente dal lancinante, che può essere presente in intatte, non accoltellati campioni (Figura 5C </strong&gt;). Questi campioni devono essere scartati. La degenerazione è molto probabilmente causato da dissezione ruvida, che può strappare i nervi e lo strato protettivo della glia superficie. Così grande cura deve essere presa per analizzare delicatamente. Altri fattori che influenzano sono il terreno di coltura, che deve essere tenuto pulito e con gli antibiotici, attenendosi strettamente ai lavaggi e tempi come indicato nel protocollo. Infine, la lunghezza del supporto dell&#39;ago e l&#39;ago, la dimensione e la nitidezza dell&#39;ago sono molto importanti. Il supporto dell&#39;ago può contaminare il terreno di coltura e un ago smussato può causare lesioni di grandi dimensioni che non si ripara e porterà alla degenerazione. È importante mantenere normalmente l&#39;ago appuntito. In questo protocollo, abbiamo approfittato di una linea proteina trappola di mosche per visualizzare il neuropile in parallelo alla visualizzazione dei processi gliali con il tradizionale GAL4-UAS sistema. Questi strumenti possono anche essere combinati con altri sistemi di espressione binari come il LexA 19 e Q-system 20, che sono indipendenti GAL4. Ciò consentirebbe l&#39;analisi delle interazioni per esempio tra assoni e processi gliali, in risposta al danno. Con ulteriormente combinazione con altri strumenti genetici come reporter per dendriti 21 o afflusso di calcio 22, questo metodo fornisce una grande opportunità per analizzare la biologia cellulare dietro la risposta lesione delle cellule gliali, gli assoni e dendriti neuronali nel SNC. Infine, questo metodo può essere combinato con standard di genetica, mutazioni e sovra-espressione di geni, per testare la funzione genica in risposta alle ferite e rigenerazione. Questo protocollo è successo portato alla scoperta di una rete gene sottostante la risposta rigenerativa gliale a lesioni CNS 11. Data la conservazione evolutiva della funzione del gene, dipanando questi eventi cellulari e funzioni geniche in frutta mosche è tale da offrire spunti significativi nella comprensione della maCNS mmalian risposta al danno e la rigenerazione.

Rigenerazione in animali rivela che le cellule percepire quando la crescita dell&#39;organismo è ordinato e completo, e in che modo l&#39;integrità strutturale di un organismo è raggiunto e mantenuto. La comprensione di queste misteriose capacità di cellule è di grande interesse per la biologia. Promuovere la rigenerazione è uno degli obiettivi chiave per medico neuroscienze. Negli esseri umani, il danneggiato sistema nervoso centrale (CNS) non rigenera. Modelli di roditori di lesioni del midollo spinale sono utilizzati per comprendere come le cellule rispondono al danno. Tuttavia, le questioni etiche, i costi elevati e il ciclo di vita degli animali lenta limitano il progresso. Il moscerino della frutta Drosophila è un organismo modello molto utilizzato in biologia dello sviluppo e delle neuroscienze. Grazie ai suoi potenti strumenti genetici e ciclo di vita breve, Drosophila ha ripetutamente portato alla scoperta delle funzioni dei geni e delle reti di geni con rilevanza per la comprensione degli esseri umani e le malattie. Ci sono prove abbondanti di con evolutivaconservazione della funzione del gene dalle mosche per l&#39;uomo. Negli ultimi anni, diversi paradigmi per le lesioni del sistema nervoso sono stati stabiliti in Drosophila. Alcuni sono costituiti da danneggiare nervi periferici che corrono lungo l&#39;ala o assotomia dei nervi periferici, di cui 1 sensoriali e motori assoni 2. Tuttavia, i sistemi nervoso centrale e periferico differiscono per molti aspetti, ed è ben noto che in molti animali il sistema nervoso periferico che può rigenerare il CNS non può. Così, per capire la rigenerazione del SNC, danno diretto al sistema nervoso centrale è più appropriato. Lesioni accoltellato con un ago è stato applicato con successo al cervello adulto Drosophila per studiare la risposta al danno 3,4. Utilizzando un metodo diverso, Ayaz et al. Assoni del sistema nervoso centrale mozzate nel cervello adulto in coltura con una potenza piezo microdissector, e analizzato la loro rigenerazione per 4 giorni 5. Il vantaggio di questi u set dopo sperimentaleps è che si concentrano sul cervello, che è senza dubbio di grande interesse. Lo svantaggio è che il cervello è molto più complesso rispetto al VNC, che si occupa solo di motore e di controllo sensoriale. Lavorare sul cervello adulto è anche più tempo. La larva è pronto per esperimenti in 4 giorni, mentre ci vogliono circa 10 giorni per eclosion adulti, e poi altri 5 giorni per la loro maturazione. Il cervello adulto è anche più difficile da gestire, perché è incapsulato in spessa cuticola, che è difficile da rimuovere. Il VNC ha l&#39;attrazione ulteriore di essere funzionalmente equivalente al midollo spinale vertebrato. La larva di Drosophila è ampiamente utilizzato come organismo modello per le neuroscienze 6-9. Sebbene strettamente parlando la larva è in una fase di sviluppo, può anche essere considerato un animale completamente funzionale. La larva ha locomozione, dei sensi multiple, tra cui l&#39;olfatto, il gusto e nocicezione, e l&#39;apprendimento e la memoria. Così, il larvale VNC wa scelta come il modello ideale per le lesioni del SNC. VNCs larvali e di pupa può essere sezionato e coltivate in piatto, mantenendo l&#39;integrità cellulare per un massimo di 24 ore 10. Questo suggerisce che il pregiudizio potrebbe essere applicato al VNC, che potrebbe quindi essere registrate in time-lapse per questo periodo di tempo, o coltivati ​​e fissato in qualsiasi punto di tempo desiderato entro questo periodo. Qui, presentiamo un paradigma sperimentale per le lesioni del SNC utilizzando la Drosophila larvale VNC. Il VNC viene prima sezionato dalla larva, e lesioni lancinante si applica manualmente con un ago di tungsteno. Il VNC è poi posto su un fondo di vetro coprioggetto, e girato con time-lapse microscopia confocale a scansione laser. In alternativa, i VNCs possono essere coltivate per un periodo di tempo desiderato, e gli effetti cellulari di lesioni possono essere analizzati in campioni fissati mediante immunocolorazione e microscopia confocale. L&#39;area della ferita può essere misurata, e l&#39;analisi quantitativa di cellule number (proliferazione cellulare e morte cellulare) può essere effettuata con il software appositamente sviluppato. Dimensioni del campione di grandi dimensioni possono essere facilmente gestiti, con conseguente risultati statisticamente convalidati. Questi metodi sono stati con successo in combinazione con la genetica potenti di Drosophila per scoprire una rete gene alla base della risposta gliale rigenerativa a lesioni del SNC 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Colorazione blocco </td><td> Brunel Microscopio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinze No. 5 </td><td> ad esempio, strumenti per le scienze Arti </td><td> ad esempio 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Tungsteno ago: diametro dello stelo, 0,5 mm, dimensioni della punta, 1 micron, lunghezza, da 2 pollici </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-6065 </td><td></td></tr><tr><td> Porta aghi </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-6060 </td><td></td></tr><tr><td> Arkansans pietre: Kit di riparazione per Dumont Pinza </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 29000-00 </td><td></td></tr><tr><td> 35 millimetri capsula di Petri con il 27 mm base in vetro </td><td> Iwaki </td><td> 3930-035 </td><td></td></tr><tr><td> Leica SP2-AOBS confocale microscopio invertito con camera ambiente </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Shield e Sang M3 insetti medie (ecdisone gratuito) </td><td> Sigma </td><td> S3652-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina e streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone fosfato salino (PBS) </td><td> Vedi 12 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Sigma </td><td> F7524 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P1399-25mg </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeide, 10%, metanolo libero, Pure Ultra </td><td> Polysciences </td><td> 04018-1 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Mouse anti-glutammina sintetasi anticorpi </td><td> Millipore </td><td> MAB302 </td><td></td></tr><tr><td> Coniglio anti-GFP anticorpi </td><td> Life Technologies </td><td> A11122 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse anti-REPO anticorpi </td><td> Developmental Studies Ibridoma banca </td><td> 8D12 </td><td></td></tr><tr><td> Rat anticorpi anti-ELAV </td><td> Developmental Studies Ibridoma banca </td><td> 7E8A10 </td><td></td></tr><tr><td> Coniglio anti-caspasi 3 anticorpi attivi </td><td> Abcam </td><td> ab13847 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-coniglio Alexa Fluor 488 </td><td> Life Technologies </td><td> A11034 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo Alexa Fluor 647 </td><td&gt; Vita tecnologie </td><td> A21236 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo Alexa Fluor 647 </td><td> Life Technologies </td><td> A21247 </td><td></td></tr></tbody></table>

an injury paradigm to investigate central nervous system repair in drosophila

Un metodo sperimentale è stato sviluppato per studiare le risposte cellulari al sistema nervoso centrale (SNC) infortunio con il moscerino della frutta Drosophila. Comprensione riparazione e la rigenerazione negli animali è una questione fondamentale in biologia. La CNS danneggiati umani non si rigenera, e capire come promuovere la rigenerazione è uno degli obiettivi principali del medico neuroscienze. Il toolkit potente genetica della Drosophila può essere utilizzato per affrontare il problema della rigenerazione del SNC. Una lesione al cordone nervoso ventrale CNS (VNC, equivalente al midollo spinale vertebrato) viene applicato manualmente con un ago di tungsteno. Il VNC può essere successivamente girato in time-lapse utilizzando la scansione microscopia confocale laser per un massimo di 24 ore per seguire lo sviluppo della lesione nel tempo. In alternativa, può essere coltivato, poi fissate e colorate con immunofluorescenza per visualizzare neuroni e cellule gliali con microscopia confocale. L&#39;uso dei marcatori appropriati, chaNGES della morfologia cellulare e stato della cellula come risultato di lesioni può essere visualizzato. Con ImageJ e appositamente sviluppato plug-in, analisi quantitative e statistiche possono essere effettuati per misurare le variazioni di dimensione della ferita nel tempo e gli effetti di lesioni nella proliferazione cellulare e morte cellulare. Questi metodi consentono l&#39;analisi di campioni di grandi dimensioni. Possono essere combinati con la genetica potenti di Drosophila per indagare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione del SNC e la riparazione.

Qui vi mostriamo come eseguire lesioni pugnalata al larvale Drosophila VNC e analizzare le risposte cellulari al danno con time-lapse e immunostaining microscopia confocale a fluorescenza. Per time-lapse dati, la lesione è visualizzato come una GFP-negativo area all&#39;interno della neuropile di esemplari recanti il marcatore assonale G9 (Figura 2). Poco dopo accoltellamento, piccole aree GFP-negativi, che sembrano buchi o vacuoli, cominciano ad apparire (Figura 2A). Tale GFP-negativi aree generalmente ingrandire fino a circa 6-8 ore dopo accoltellamento (Figura 2A). Successivamente, le GFP-negativi aree restringono e può anche scomparire (Figura 2B). Da 22 ore dopo accoltellamento, l&#39;area occupata dalla ferita è generalmente inferiore alla superficie massima era a 6 a 8 ore dopo accoltellamento (figure 2A, B). Analogamente il DsRed-negativo zona processi gliali aumenta inizialmente troppo, ma Shirinks da 22 ore dopo l&#39;accoltellamento. Curiosamente, spesso processi gliali DsRed-positivi riempire le GFP-negativi fori nel neuropile prima della loro scomparsa (Figura 2C). Utilizzo immunocolorazione in campioni fissati, belle processi gliali e la loro risposta a lesioni possono essere visualizzati con una risoluzione migliore che con time-lapse immagini. Questo può essere fatto, per esempio, utilizzando il conducente repoGAL4 gliale di indurre l&#39;espressione di un reporter membrana tethered (es UAS-mCD8GFP) in linea di visualizzare tutte le cellule gliali (tranne la glia linea mediana). Questo può anche essere combinato con altri marcatori gliali, come anti-GS2, che etichetta cellule gliali neuropile-associati (figure 3A, B). Qui si dimostra che anche se il cordone nervoso ventrale viene pugnalato dal lato dorsale, lancinante risultati pregiudizio in un dente ventrale (figura 3a, punte di freccia). Stabbing sembra interessare più severamente l&#39;neuropile e neuropile-esima associata cellule glialiuna superficie corteccia e cellule gliali (Figura 3B). Processi gliali appaiono disorganizzati nel neuropile, mentre continuano a mantenere la loro rete come l&#39;organizzazione della corteccia. Risultati infortuni in GS2-positivo detriti cellulari, che si distingue da cellule normali come frammenti di detriti sono molto più piccoli e non collegato ad un corpo cellulare. Questo rivela danni alle cellule gliali neuropile-associati (Figura 3B). Degenerando neuropile associate cellule gliali sono state osservate anche al microscopio elettronico 15. Anti-spaccati-Caspasi 3 apoptosi + colorazione si osserva nelle cellule gliali neuropile-associati 15, dimostrando di apoptosi su accoltellamento lesioni. Neuropile cellule gliali sono stati associati anche dimostrato di fagocitare i detriti neuronale 15, e GS2 + segnale potrebbe anche rivelare l&#39;immersione dei neuroni apoptotici da processi gliali. Spaccati-caspasi + cellule apoptotiche sono anche osservati nella corteccia, almeno alcuni dei quali corrispondono a Elav + neuroni ( <strong&gt; Figura 3C). Utilizzando campioni fissi e immunocolorazione permette anche analisi quantitative delle risposte cellulari al danno, come ad esempio gli effetti di proliferazione e apoptosi. Per questo, abbiamo volutamente sviluppato due ImageJ plug-in, Larva Caspase DeadEasy e glia DeadEasy, a contare automaticamente il numero di cellule gliali e cellule apoptotiche, rispettivamente. Essi sono stati convalidati per lavorare su VNCs larvali e sono molto precisi. Usando questi, è possibile osservare un aumento del numero di cellule gliali REPO-positivi causati da lesioni lancinante, da 22 ore (Figura 4A) 15. Vi è anche un aumento del numero di cellule apoptotiche anti-spaccati-caspasi-3 da 6 ore post-stabbing (Figura 4B) 15. Tale aumento nella proliferazione gliale e apoptosi in risposta al danno del SNC Drosophila ricorda la risposta lesione nel SNC vertebrati. Un aspetto cruciale di questa proprotocollo è la qualità del dissezioni VNC. È difficile dire al momento della dissezione se le VNCs sono stati danneggiati o non nel processo. E &#39;importante prestare particolare attenzione per eseguire dissezioni dolci. Tuttavia, i campioni di cattiva qualità sarà inevitabilmente prodotta, ed è essenziale che questi sono identificati in fasi successive e scartato. Nelle nostre mani, la degenerazione VNC apparentemente non correlato al danno, ma causata da dissezione ruvida. Non abbiamo osservato una dimensione critica nella ferita ferite, e analizziamo tutti i campioni infortunati che non sono degradati. Quando VNCs mantenere la loro integrità, la superficie VNC tende a guardare liscia e lucida, e senza fori nel neuropile si osservano (Figura 5A). Degradazione di VNCs può essere riconosciuto da 24 hr post-dissezione dalla superficie ruvida delle zone VNC ventrali e laterali (Figura 5B). La degradazione della neuropile estranei a danno coltellate può anche verificarsi, ed è riconosciuto come neuropile holes del segnale di fondo di esemplari immunocolorate. I campioni con questi segni di degenerazione deve essere scartata (Figura 5C). Nelle nostre mani, il tasso di successo per la dissezione e lesioni nel controllo intatta e accoltellato (yw) mosche sono entrambi intorno al 70%. Questo tasso varia con l&#39;abilità di chi esegue gli esperimenti, e con il genotipo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di disegno di larve di sosta e accoltellato lesioni. (A) al giorno 0, mosche possono deporre le uova in una capsula di Petri succo d&#39;uva per 3 ore. Al giorno 1, il tratteggio larve primo stadio (L1) vengono raccolti e collocati in fiale contenenti cibo standard lievito, dove sono conservati per altri 3 giorni. Al giorno 4, le larve vengono raccolti dalla fiala cibo, e utilizzati per gli esperimenti lancinanti. (B) Vista laterale della larva sistema nervoso centrale.La regione addominale del cordone nervoso ventrale viene pugnalato con un ago dal lato dorsale. Anteriore è a sinistra, posteriore e verso destra. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" /> Figura 2. Time-lapse progressione della lesione VNC. Microscopia confocale in vivo con VNCs assoni GFP-etichettati e DsRed-etichettati cellule gliali. Genotipo:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) La lesione è riconosciuta dalla mancanza di fluorescenza sul neuropile assonale. Dopo aver accoltellato, GFP-negativi fori appaiono, poi aumentando in dimensioni e numero. Proiezioni su 5 sezioni ottiche da ogni punto dopo accoltellamento infortunio. (B) Gli assoni si restringe lesione neuropile di 9 ore dopo l&#39;accoltellamento. Queste immagini sono singole sezioni ottiche di diversi tempi dopo l&#39;accoltellamento infortunio. Per identificare posizioni equivalenti in ogni campione, il numero di slice stesso da EAtempo punto ch nella pila di time-lapse dei dati è stato scelto. Confrontando i modelli visualizzati con G9 e repoGAL4&gt; UASmCD8GFP nella zona non interessata dal l&#39;accoltellamento, le fette sono state verificate come da posizioni equivalenti nel asse Z. Linee tratteggiate in (A, B) indica il bordo della ferita. (C) Alto ingrandimento ferite sul neuropile. GFP-negativi fori sono stati riempiti con i processi gliali DsRed-positivi, e successivamente scomparsa (punte di freccia). Vista orizzontale. Up anteriore. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" /> Figura 3. Caratterizzazione cellulare di lesione VNC. VNCs recanti un giornalista legato membrana GFP per tutte le cellule gliali (tranne glia linea mediana) colorati con anti-GFP e anti-GS2, una neuropile associata marcatore delle cellule gliali. Genotipo:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNCs sono stati accoltellati da dorsal lato, ma questo causa una ammaccatura ventrale (punte di freccia). Vista sagittale di singole sezioni ottiche, dorsale sinistro e anteriore. (A, B) Stabbing pregiudizio colpisce più gravemente neuropile associata a cellule gliali rispetto alle cellule della corteccia e la superficie gliali. Risultati infortuni in GS2-positivo detriti cellulari (punte di freccia in B). (B) Vista orizzontale delle singole sezioni ottiche, fino anteriore. Frecce indicano GS2 + detriti cellulari. (C) Colocalisation del marcatore anti-apoptotico spaccati-caspasi-3 e il marcatore neuronale anti-Elav mostrando che al pregiudizio alcune delle cellule morenti nella corteccia sono neuroni. np, neuropile, cx, corteccia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" /> Figura 4. Conteggio automatico delle cellule gliali e cellule apoptotiche con DeadEasy. (A) Esempio di utilizzo di &#39;glia DeadEasy larvale&#39; contare REPO positivocellule gliali. A sinistra, la metà VNC ventrali colorate con anticorpi anti-pronti contro termine; medie: uscita da DeadEasy glia larvale nascondere le celle identificate dal plug-in, a destra si fondono. I numeri sulla destra sono il numero di REPO-positive cellule contate automaticamente in una pila di sezioni ottiche confocale in circa 30 secondi. Il numero di aumenti glia nei VNCs accoltellati. (B) Esempio di utilizzo di &#39;larva DeadEasy Caspase&#39;. Proiezioni su 5 sezioni ottiche confocale colorate con anti-spaccati-caspasi 3 anticorpi; medie:: Sinistra uscita nascondere le celle identificate dal plug-in, a destra si fondono. I numeri sulla destra sono il numero di caspasi-positive cellule contate automaticamente in una pila di sezioni ottiche confocale in circa 30 secondi. Il numero di cellule apoptotiche aumenta nel pugnalato VNC. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" /> Figura 5. Esempi di degeneratione. (A) Un sano VNC. Non ci sono segni di degenerazione. (B) Il lato del torace sta degenerando (punte di freccia) in un campione accoltellato. L&#39;asterisco indica luogo della lesione. (C) Fori nel neuropile toracica (freccia bianca) e la corteccia (arancione punta di freccia) in modo non pugnalato VNC. I campioni con danneggiato vacuolizzazione neuropile ed estesa deve essere eliminato. Qui VNCs sono state colorate con il pennarello neuropile associato gliale anti-Ebony. Vista orizzontale, fino anteriore.

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An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Un paradigma danno usando il cavo larvale nervoso ventrale Drosophila per studiare la rigenerazione del sistema nervoso centrale e la riparazione è descritto. Stabbing seguito da scansione laser microscopia confocale in time-lapse e fissi campioni, combinata con l&#39;analisi quantitativa con software volutamente sviluppato e genetica, sono utilizzati per studiare i meccanismi molecolari della rigenerazione e riparazione del SNC.

Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

13.2K Views.  University of Birmingham. Un paradigma danno usando il cavo larvale nervoso ventrale Drosophila per studiare la rigenerazione del sistema nervoso centrale e la riparazione è descritto. Stabbing seguito da scansione laser microscopia confocale in time-lapse e fissi campioni, combinata con l'analisi quantitativa con software volutamente sviluppato e genetica, sono utilizzati per studiare i meccanismi molecolari della rigenerazione e riparazione del SNC.

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Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Ricerca

Neuroscienze

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

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Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatorio del Sistema Nervoso Centrale Translatome da Polyribosome Frazionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing ottica del sistema nervoso centrale del mouse Utilizzando CHIAREZZA passivo

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are limited resources directing scientists in the techniques for measuring and analyzing these variables. This protocol describes the methods for measuring RSNA and mean arterial pressure in anesthetized rats. The protocol also includes the approaches for accessing the brain during RSNA recordings for central nervous system (CNS) manipulations. The RSNA recording technique is compatible with pharmacologic, optogenetic, or electrical stimulation of the CNS. The approach is useful when an investigator will measure short-term (min to h) autonomic responses in non-survival experiments to correlate anatomically with CNS nuclei. The approach is not intended to be used to obtain chronic (survival) recordings of RSNA in rats. Discharges in RSNA, averaged rectified RSNA, and mean arterial pressure can be quantified and analyzed further using parametric statistical tests. Methods for obtaining venous access, recording mean arterial pressure telemetrically, and brain fixation for future histological analysis are also described in the article.

Methods for measuring sympathetic and cardiovascular responses to central nervous system (CNS) manipulations are important for advancing neuroscience. This protocol was developed to assist scientists with measuring and quantifying acute changes in renal sympathetic nerve activity (RSNA) in anesthetized rats (non-survival).

Quantificare i cambiamenti acuti nell'attività comprensiva renale del nervo in risposta a manipolazioni del sistema nervoso centrale in ratti anestetizzati

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...