Poiché i batteri sono così piccoli, le persone spesso dimenticano di essere oggetti tridimensionali. Il nostro protocollo consente un'accurata ricostruzione delle forme delle celle piatte e curve. Questo protocollo richiede solo lievi modifiche a un microscopio standard e sono prontamente disponibili negli script MATLAB.
Prima di iniziare l'esperimento, posizionare due pile di ciascuno dei tre coperchi da 20 x 20 millimetri sulle estremità opposte di un singolo vetrino al microscopio di vetro. Pipettare 200 microlitri di soluzione di cuscinetto di agarosio sullo scivolo e posizionare immediatamente e saldamente un secondo scivolo sulla pila di scivolamenti di copertura per appiattire l'agarosio. Dopo aver permesso all'agarosio di solidificarsi per circa un minuto a temperatura ambiente, scivolare accuratamente fuori dallo scivolo superiore e utilizzare una grande estremità di una punta della pipetta da 200 microlitri per tagliare singoli cuscinetti da cinque millimetri di diametro dal gel.
Quando tutti i cuscinetti sono stati ottenuti pipettare la coltura cellulare E.coli più volte per interrompere eventuali ciuffi cellulari e per garantire che le cellule siano distribuite in modo omogeneo prima di aggiungere un microlitro di sottocoltura su ogni cuscinetto. Dopo aver lasciato asciugare i campioni all'aria per cinque o 10 minuti, confermare che le goccioline sono state completamente assorbite nei cuscinetti prima di posizionare un coperchio scivolare sui cuscinetti. Quindi utilizzare un batuffolo di cotone per spazzolare delicatamente un sigillante appropriato intorno al bordo dello scivolo di copertura, facendo attenzione a tenere il sigillante lontano dalla parte superiore dello scivolo di copertura.
Subito dopo aver sigillato lo slittamento del coperchio posizionare lo scivolo su uno stadio di microscopio e dopo cinque minuti di equilibrazione termica utilizzare le ruote di messa a fuoco del microscopio per mettere a fuoco il centro di una cella. Nel software del microscopio associato in ND Acquisition, selezionare la casella Z per acquisire uno stack Z e fare clic sul pulsante Home per impostare il centro della cella come punto di partenza. Impostare la dimensione del passo su 0,1 micrometri e l'intervallo su quattro micrometri e assicurarsi che il dispositivo Z sia impostato sulla fase Piezo.
È fondamentale che ci sia una sfocatura sufficiente sia nella parte superiore che in quella inferiore della cella in modo che la cellula sia quasi indistinguibile dallo sfondo. Impostare i canali fluorescenti sotto la finestra lambda sulle impostazioni per le molecole fluorescenti da immagini e confermare che l'ordine dell'esperimento è impostato su lambda in modo che venga ottenuta una pila Z completa in ogni canale di colore prima di passare. Quindi fare clic su Esegui ora per iniziare l'acquisizione dell'immagine.
Una volta acquisite tutte le immagini, aprire i file in un programma software di analisi delle immagini appropriato. Disegnare una casella intorno a una singola cella e duplicarlo due volte, una volta per ogni canale, assicurandosi che la casella Iperstack duplicato sia selezionata e modificare il canale in uno o due. Una volta che entrambi gli stack sono disponibili, selezionate Immagini, Pile, Strumenti e Concatena per combinare le immagini.
Con prima il canale proteico e il canale di forma secondo. Dopo aver salvato la nuova immagine come file TIFF, crea una cartella all'interno di una cartella sul desktop che contiene le immagini ritagliate e il cell_shape_settings_tri. txt da shae-cellshape-public exampleData_tri.
Modificare la cell_shape_settings_tri. txt per avere le impostazioni corrette per l'esperimento di interesse. Ed eseguire la Cell_shape_detector3dConvTriFolder con la stringa nel percorso della cartella seguita dal numero della cella su cui iniziare e dal numero di celle che devono essere eseguite.
Per verificare che le celle siano state ricostruite correttamente, eseguire ScreenFits. Quando si apre l'interfaccia utente grafica, fare clic sul pulsante Seleziona cartella e selezionare la cartella con i file di dati di ricostruzione per schermare visivamente le singole ricostruzioni di celle. Per tutte le celle che appaiono deformi o prive di copertura completa, selezionare la casella accanto alla ricostruzione per aggiungere flag al nome in modo che possa essere esclusa da qualsiasi analisi downstream.
Arricchimento di corsaSmothingSpline per creare un profilo di arricchimento della concentrazione relativa della proteina di interesse in funzione della curvatura gaussiana sulla superficie. Quindi selezionare ogni cartella con il TRI appena creato. mat e selezionare il file del tappetino curva appena creato.
Questo metodo è particolarmente utile quando si trattano cellule curve o a forma anomala poiché una rappresentazione 2D non può riflettere accuratamente la curvatura delle celle. In questo esperimento è stata generata una proteina di fusione fluorescente verde alla proteina actina batterica MreB per studiare la localizzazione precisa della proteina actina sia nelle cellule E.coli di tipo selvatico che mutanti. Effettuando queste misurazioni in immagini catturate in 3D, le forme sia del tipo selvaggio che delle cellule mutanti rodZ sono state in grado di essere ricostruite.
La localizzazione di MreB è stata quindi determinata per essere arricchita a piccole curvature gaussiane, una caratteristica geometrica che può essere misurata solo in 3D in modo dipendente da rodZ. Ricordarsi di assicurarsi che lo stack Z sia abbastanza grande da far sfocare le celle nella parte superiore e inferiore e che le celle siano ben distanziate l'una dall'altra. Stiamo mostrando come misurare la localizzazione geometrica delle proteine in 3D, ma altre informazioni possono essere calcolate da questi dati come la dimensione degli assiemi di proteine tag.
