Questo metodo pratico e riproducibile può essere utilizzato per visualizzare le interazioni con i leucociti dell'endotelio che portano al reclutamento di leucociti all'interno di un topo intatto. Questa tecnica presenta anche un potente strumento per il monitoraggio dei processi fisiologici e fisiopatologici all'interno della cascata di reclutamento dei leucociti in vivo. Il metodo può essere applicato in diversi modelli infiammatori e settici.
Ad esempio, abbiamo recentemente evidenziato la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che comportano infiltrazioni esagerate di leucociti muscolari. Il nostro suggerimento ai colleghi scienziati che stanno pensando di utilizzare questa tecnica è di ottenere quanta più esperienza pratica possibile il metodo è molto suscettibile a piccole deviazioni. A dimostrare la procedura sarà Simon Kranig, un clinico e scienziato anziano del mio laboratorio.
Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piede nell'animale sperimentale anestetizzato, fissare il mouse in posizione reclinata dorsale su una pastiglia riscaldante Celsius di 37 gradi e utilizzare una sutura sterile 6-0 non assorbibile per avvolgere un semplice anello intorno ai denti frontali. Rastrettare le estremità di giunzione della sutura sul riscaldante e utilizzare le pinzette per sollevare delicatamente la pelle a metà linea. Successivamente, fare un'incisione circolare da uno a due centimetri di diametro sul collo e sul torace superiore e utilizzare una pinzetta per sezionare attentamente i tessuti muscolari, grassi e connettivi circostanti.
Metti una sutura sotto la trachea. Utilizzare piccole forbici chirurgiche per fare un taglio trasversale di circa 1,3 millimetri nella trachea e introdurre un tubo di polietilene nell'estremità caudale della trachea per fissare le vie aeree superiori. Fissare il tubo situato con un'unica sutura a nodo circolare e individuare l'arteria carotide lungo il lato destro della trachea.
Sezionare il tessuto circostante dalla parete dell'arteria carotide e passare due pezzi di sutura sotto l'arteria. Legare la prima sutura cranica prossimale alla biforcazione delle arterie carotidi e posizionare la seconda sutura a circa cinque-otto millimetri distale dalla prima sutura senza legare. Successivamente, attaccare un pezzo di tubi di polietilene di 30 centimetri a un ago della siringa da un millilitro riempito con soluzione salina e utilizzare una clip per vasi di sette millimetri per bloccare l'arteria carotide distorsi alla seconda sutura.
Effettuare un taglio trasversale di circa 0,5 millimetri nell'arteria carotide e introdurre il tubo sterile in polietilene nell'arteria. Fissare il tubo con la seconda sutura e rimuovere la clip del recipiente. Quindi deprimere delicatamente lo stantuffo della siringa per lavare la soluzione salina nel vaso.
Per preparare il muscolo cremastere, trasferire il mouse su un telaio al microscopio in plastica su misura con lo scroto rivolto verso lo stadio del microscopio e afferrare attentamente lo scroto alla sua estremità più distale con una pinzetta. Tirando delicatamente lo scroto, rimuovere una sezione circolare di circa cinque millimetri di diametro della pelle scrotale mantenendo il tessuto aperto ben idratato con soluzione salina. Utilizzare due pinzette per sezionare il tessuto connettivo sciolto e localizzare entrambi i teste.
Afferrare un testicolo distally e iniziare delicatamente a estrarre il tessuto riproduttivo rimuovendo i tessuti connettivi circostanti passo dopo passo. Una volta che il testicolo è stato esteriore, fissare l'estremità distale del tessuto all'anello di gomma che circonda il palco e idratare il tessuto con soluzione salina. Quindi, rimuovere con cura il tessuto connettivo senza danneggiare il muscolo cremastere sottostante.
È fondamentale rimuovere tutto il tessuto connettivo che si tradurrebbe in immagini sfocate senza danneggiare il muscolo cremastere sottostante. Quando tutto il tessuto è stato rimosso, fare un'incisione trasversale di un millimetro per aprire il muscolo cremastere prima di fare un'incisione longitudinale dall'estremità molto distale all'estremità prossimale del tessuto. Il muscolo dovrebbe aprirsi sfericamente.
Stendere con cura il muscolo sul palco di vetro e inchiodare il muscolo all'anello di gomma facendo attenzione a non toccare o danneggiare la regione centrale del tessuto. Quindi fissare il testicolo rimanente di lato per dare accesso alla regione di interesse e idratare il tessuto con PSS. Per la visualizzazione intravitale della vascuola muscolare, posizionare il muscolo cremastere montato nel microscopio verticale e selezionare l'obiettivo 40X.
Eseguire le registrazioni sotto superfusione continua con PSS da 35 a 37 gradi Celsius attraverso un pezzo di piccoli tubi che è stato attaccato all'obiettivo verticale del microscopio per consentire il gocciolamento continuo di PSS insieme all'obiettivo verso il basso sul muscolo e sul tessuto. Identificare le venule post-capillari. Misurare il microcircolo su venyole con un diametro da 20 a 40 micrometri.
Quindi registrare immagini ad alta risoluzione del microcircolo dal muscolo cremastere per un periodo di 30 secondi regolando continuamente la messa a fuoco a causa di lievi cambiamenti nella contrazione e rilassamento del tessuto muscolare. L'eccesso di tessuto connettivo può portare a immagini microscopiche sfocate. In questa immagine microscopica rappresentativa, le venule post-capillari che dovrebbero avere un diametro compreso tra 20 e 40 micrometri possono essere identificate dalla confluenza di due vasi più piccoli.
I leucociti aderenti e rotolanti possono essere visualizzati mentre i leucociti circolanti possono essere tracciati solo nella riproduzione al rallentatore di video registrati. Una moltitudine di parametri può influenzare il reclutamento di leucociti in vivo tra cui l'uscita cardiaca, il diametro del vaso, la velocità dell'uscita centrale, la velocità di taglio delle pareti e il numero di leucociti circolanti. Si noti che la velocità dell'uscita della linea centrale è influenzata dall'uscita cardiaca, dalla resistenza vascolare periferica e dal volume intravasale.
Ad esempio, un grande volume di rhodamina o altra sostanza sperimentale somministrata attraverso il catetere carotide aumenta la velocità dell'ala centrale post-capillare e inibisce la cattura e il rotolamento dei leucociti. Al contrario, l'insufficienza cardiaca, l'anestesia profonda o l'ipotermia possono diminuire il flusso post-capillare. Per determinare la velocità della linea centrale, possono essere utilizzati leucociti fluorescenti che circolano liberamente o i leucociti devono essere tinti con reagenti fluorescenti come la rodiammina.
Si noti che i ceppi di tipo selvatico possono mostrare una varianza fisiologica. Ad esempio, i topi C57BL/6 dimostrano una laminazione, un'adesione e una trasmigrazione dei leucociti chiaramente migliorate rispetto agli animali C57BL/10ScSn. Le fasi di pianificazione e standardizzazione sono importanti per padroneggiare la tecnica soprattutto durante la preparazione del muscolo cremastere per la microscopia.
Altri metodi per visualizzare il reclutamento di leucociti possono essere condotti per fornire ulteriori informazioni e per aiutare a sezionare il contributo individuale dei leucociti e delle cellule endoteliali alla cascata di reclutamento. Questa tecnica fornisce una piattaforma per la valutazione preclinica dei meditatori farmacologici e delle nuove sostanze modulatori immunitarie.
