Il rilascio di trappole extracellulari da parte di neutrofili e altre cellule immunitarie è importante nell'immunità innata ma anche fortemente legato a patologie infiammatorie. Si sa molto poco di questo processo nei macrofagi anche se queste cellule svolgono un ruolo critico nella risposta infiammatoria. Questo protocollo fornisce un modello umano primario in vitro di trappola extracellulare di macrofagi o rilascio di alberi.
Ci fornisce un modello per studiare una potenziale crescita fisiologica di questa struttura in vivo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule di questo protocollo sono cellule primarie isolate dai preparati umani di buffy coat. Non è necessario alcun passo di adescamento per differenziare il monocita in macrofagi, che è in contrasto con altre linee cellulari monocite come la linea cellulare THP-1.
Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre cellule immunitarie tra cui neutrofilo isolato e microglia. La trappola extracellulare prodotta dai macrofagi è molto fragile, quindi bisogna fare attenzione tra un passo e l'altro per preservare l'integrità delle trappole macchiate. In condizioni sterili, preparare il mezzo di adescamento M1 aggiungendo al mezzo di coltura RPMI-1640 completo, gamma di interferone alla concentrazione di 20 nanogrammi per millilitro e lipopaccaride alla concentrazione di un microgrammo per millilitro.
Preparare i supporti di adescamento M2 aggiungendo l'interleuchina 4 al supporto di coltura RPMI-1640 completo alla concentrazione di 20 nanogrammi per millilitro. In condizioni sterili, aspirare i supporti dai pozzi di coltura dei tessuti seminati e coltivati contenenti HMDM. Aggiungere con cura in ogni pozzo, un millilitro di PBS sterile pre-riscaldato a 37 gradi Celsius.
Rimuovere il buffer PBS e lavare altre due volte. Aggiungere un millilitro del supporto di adescamento M1 o M2 a ciascun pozzo contenente l'HMDM. Incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica in un incubatore di cellule.
In condizioni sterili, preparare i supporti di coltura contenenti diversi stimolatori del rilascio di MET sui supporti RPMI-1640 completi. Per gli esperimenti con stimolazione dell'acido ipocloroso, preparare 200 micromolari di acido ipocloroso in un tubo Falcon con HBSS che è stato pre-riscaldato a 37 gradi Celsius. Dopo il trattamento di polarizzazione, aspirare il supporto cellulare da ogni pozzo e lavare accuratamente le cellule tre volte con aliquote di millilitro di PBS sterile per la stimolazione di PMA, TNF alpha e interleuchina 8 o HBSS per la stimolazione dell'acido ipocloroso.
Dopo aver rimosso il PBS nella fase finale di lavaggio, aggiungere un millilitro di supporti completi contenenti PMA, TNF alpha o interleuchina 8. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in un incubatore di cellule per sei ore per la stimolazione alfa TNF e 24 ore per la stimolazione PMA o interleuchina 8. Per gli esperimenti con acido ipocloroso, dopo aver rimosso l'HBSS nella fase finale di lavaggio, aggiungere un millilitro di acido ipocloroso appena preparato.
Quindi incubare le cellule per 15 minuti a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica in un incubatore di cellule. Successivamente, aspirare attentamente il supernatante delle cellule e lavare le cellule tre volte con aliquote di un millilitro di HBSS. Dopo aver rimosso l'HBSS dalla fase di lavaggio finale, aggiungere un millilitro di supporti di coltura RPMI-1640 completi.
Quindi incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica in un incubatore di cellule. Preparare il colorante verde SYTOX in HBSS a una concentrazione di 40 micromolari. Aggiungere direttamente 25 microlitri del colorante ad ogni pozzo contenente HMDM.
Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 minuti al buio. Quindi posizionare l'HMDM nei pozzi di coltura tissutale sullo stadio del microscopio di un microscopio fluorescente invertito per l'imaging. Accendi una sorgente luminosa fluorescente ad ampio spettro, una sorgente luminosa a campo luminoso e un microscopio invertito installato con una fotocamera digitale a colori ad alta risoluzione.
Ruotare la ruota filtrante nella posizione numero due per la fluorescenza verde con eccitazione a 504 nanometri e dimensione a 523 nanometri. Utilizzando l'obiettivo 5X, mettere a fuoco l'immagine con la messa a fuoco grossolana, quindi le manopole di messa a fuoco fine sul microscopio fino a quando l'immagine appare nitida, chiara e focalizzata. Passare dal microscopio alla modalità Fotocamera.
Avviare il software associato. Fare clic sul pulsante Riproduci per visualizzare in anteprima l'immagine e regolare la manopola di messa a fuoco fine sul microscopio fino a quando l'immagine appare nitida, chiara e focalizzata nella finestra di anteprima del software. Fare clic sul pulsante Acquisizione.
All'interno del software fare clic su File. Salvare come tipo di file di immagine richiesto. Al microscopio, ruotare la ruota del filtro fino alla posizione numero cinque per l'imaging a campo luminoso e ripetere le procedure di acquisizione per ottenere l'immagine del campo luminoso corrispondente.
Qui sono mostrate immagini a campo brillante che mostrano i cambiamenti morfologici dell'HMDM in risposta agli stimoli. I macrofagi polarizzati M1 da esperimenti con HMDM esposti a gamma di interferone e lipopolysaccaride mostravano una forma cellulare allungata e simile a un mandrino. Per confronto, la morfologia dei macrofagi polarizzati M2 dopo l'esposizione di HMDM all'interleuchina 4 per 48 ore era tipicamente rotonda e piatta.
La capacità dei fenotipi HMDM differenziati di rilasciare MET è stata vista dall'imaging a fluorescenza a cellule vive con verde SYTOX. Il controllo ottenuto da ogni fenotipo HMDM incubato per 24 ore in assenza di stimoli pro-infiammatori ha mostrato una colorazione verde molto limitata. La colorazione positiva per i MET, mostrata come striature verdi, è stata ottenuta con l'esposizione di M1-HMDM ad acido ipocloroso, PMA, interleuchina 8 o TNF alpha.
La presenza di alcune macchie verdi evidenti nelle cellule riflette la perdita di integrità della membrana che può derivare dalla morte cellulare che è indipendente dal rilascio di trappole extracellulari. Gli esperimenti eseguiti con M2-HMDM esposti all'interleuchina 4 non hanno mostrato alcun rilascio di DNA dalle cellule, come indicato dall'assenza dei filamenti o delle striature di DNA extracellulare. Tuttavia, c'è stata una certa diffusione cellulare del colorante fluorescente verde con l'acido ipocloroso e il TNF alfa.
È importante evitare la luce intensa diretta che può sovraesporre la colorazione prima dell'imaging. Il DNA extracellulare può essere quantificato mediante analisi qPCR sul DNA nucleare e mitocondriale presente nel supernatante cellulare. Un'ulteriore caratterizzazione della struttura dell'albero e dei suoi ruoli nell'infiammazione cronica usando l'HMDM può essere più clinicamente rilevante rispetto ad altri negozi di macrofagi della linea cellulare immortalati.
