Il protocollo consente la rappresentazione e l'analisi non invasiva e ad alta risoluzione della funzione cardiaca zebrafish adulta. Questo metodo può essere utilizzato per la convalida di modelli di malattie cardiache adulte e potenziali schermi di farmaci. Questa tecnica consente un rapido posizionamento del pesce per un'immagine corretta fornendo risultati accurati e riproducibili.
Non è invasivo ed eseguito sott'acqua che consente il rapido recupero del pesce. Per impostare la piattaforma per l'acquisizione di immagini, utilizzare piccole forbici o un bisturi per fare un'incisione su una spugna a ore 12. Posizionare la spugna in un contenitore di vetro.
Utilizzando nastro a doppia parte, apporre il contenitore di vetro contenente la spugna sulla piattaforma ad ultrasuoni. Assicurarsi che il contenitore di vetro sia al centro della piattaforma e saldamente attaccato. Inclinare la piattaforma in avanti di circa 30 gradi utilizzando la manopola sul lato sinistro del supporto della piattaforma.
Riempire il contenitore di vetro con circa 200 millilitri di acqua del sistema ittico contenente 0,2 milligrammi per millilitro tricaina metanosolfonato. Inserire il trasduttore all'interno del supporto del micromanipolatore sulla stazione ferroviaria di lavoro ruotando la tacca del trasduttore verso l'operatore. Mantenere l'array parallelo al terreno con il lato di lavoro longitudinale rispetto allo stage.
Lasciare spazio sufficiente a circa 10 centimetri su entrambi i lati per il sistema ferroviario del trasduttore ora collegato per muoversi lungo gli assi x e y. Accedere al software di controllo e scegliere il mouse piccolo vascolare. Crea un nuovo studio e una nuova serie per ogni animale indotto nello studio.
Premere il nuovo pulsante di studio situato nella parte inferiore sinistra dello schermo nella pagina del browser. La vista inizia in modalità B. Utilizzando una rete di pesce, trasferire il pesce in un piccolo serbatoio contenente acqua di sistema con 0,2 milligrammi per millilitro di tricaina.
Attendere che il pesce sia completamente anestetizzato senza movimento o nessuna risposta al tatto. Trasferire delicatamente e rapidamente il pesce nel contenitore di vetro con la spugna nell'incisione precedentemente fatta con il lato ventrale del pesce rivolto verso l'alto. Abbassare delicatamente il trasduttore utilizzando la maniglia sul sistema ferroviario posizionandolo longitudinalmente e chiudere il lato ventrale del pesce con la tacca del trasduttore rivolto verso l'operatore.
Lasciare da due a tre millimetri di sdoganamento dal pesce. Regolare la piattaforma rispetto al trasduttore utilizzando il micromanipolatore in tutti e tre gli assi fino a visualizzare il cuore del pesce. Subito dopo aver localizzare il cuore, seleziona o rimani in modalità B e riduci il campo ingrandindo per ottenere uno sguardo più da vicino al cuore.
Se necessario, migliorare la qualità o il contrasto dell'immagine impostando l'intervallo dinamico su 45-50 decibel. Passare ai controlli in modalità B nell'opzione più controlli e successivamente salvare la modifica in modalità preimpostazioni. Toccare i predefiniti della modalità per selezionare l'impostazione di acquisizione dell'immagine ottimizzata ogni volta prima di iniziare a creare un'immagine di una nuova serie.
Prendi tutte le immagini desiderate nel piano dell'asse lungo. Quindi, passa al doppler a colori per il rilevamento e l'acquisizione del flusso sanguigno. Utilizzando il touchscreen, posizionare il quadrante sopra la valvola atrioventricolare e localizzare l'afflusso che si distingue per il segnale di colore rosso.
Ridurre il più possibile l'area del quadrante per aumentare la frequenza fotogrammi. Attivate la mossa Doppler dell'onda d'impulso per campionare la velocità di afflusso del sangue ventricolare. Posizionare il cancello del volume del campione al centro della valvola atrioventricolare per rilevare la velocità massima del flusso.
Il segnale di colore rosso diventa più giallastro. Regolare l'angolo dell'onda d'impulso sullo schermo utilizzando le dita in modo che si allinei alla direzione dell'afflusso di sangue. Premere start o update per iniziare a campioare la velocità del sangue che scorre nel ventricolo.
Determinare la velocità di deflusso posizionando il quadrante Doppler a colori alla giunzione tra il ventricolo e il bulbo e localizzare il flusso. Questo si distingue per un segnale di colore blu. Posizionare il cancello del volume del campione proprio prima della giunzione del ventricolo bulbo e regolare la linea di correzione dell'angolo in modo che corrisponda alla direzione del flusso sanguigno.
Regolare la linea di base sollevarla nel pannello della velocità del flusso per rilevare e tracciare completamente i picchi del segnale. Non appena l'acquisizione dell'immagine è completa, utilizzare un cucchiaino e trasferire il pesce in acqua aerata regolare priva di tricaina e lasciare che il pesce si riprenda. Per aiutare il recupero, spruzzare ripetutamente acqua sulle branchie utilizzando una pipetta di trasferimento per promuovere l'aerazione dell'acqua e il trasferimento di ossigeno.
Di solito ci vogliono da 30 secondi a due minuti per riprendere il movimento delle branchie e il nuoto. Aprire il software di analisi delle immagini. Selezionare un'immagine e fare clic sull'icona di elaborazione delle immagini.
Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine per consentire una visualizzazione chiara delle pareti ventricolari o del modello di flusso sanguigno. Utilizzando l'immagine in modalità B, aprite l'elenco a discesa dall'opzione dell'asse lungo parasternale sulle misurazioni del pacchetto cardiaco. Selezionate traccia LV e tracciate la parete interna ventricolare a systole e diastole per ottenere l'area ventricolare in volume sistole e diastolico e diastolico e volume sistolico finale.
In questo studio, le immagini in modalità B hanno permesso di tracciare la parete interna ventricolare in sistole e diastole e ottenere dati dimensionali come le dimensioni della camera e della parete. Sono stati ottenuti anche dati funzionali come frequenza cardiaca, volume dell'ictus e uscita cardiaca, nonché parametri della funzione sistolica ventricolare, incluso il cambio di area frazionata e la frazione di espulsione. Le misurazioni a livello della valvola atrioventricolare utilizzando immagini in modalità Doppler a colori fornivano anche velocità di afflusso ventricolare e sangue in deflusso.
Sulla base dell'immagine Doppler dell'onda d'impulso, è stato generato un valore di frequenza cardiaca tracciando tre picchi di flusso aortici consecutivi. La cosa più importante è posizionare correttamente la piattaforma ad ultrasuoni e il pesce per un'imaging accurata e ridurre al minimo l'esposizione del pesce alla tricaina. Ulteriori metodi per supportare questa procedura includono l'elettrocardiogramma del pesce per il rilevamento rapido della disfunzione cardiaca come aritmie o metodi istologico per valutare la struttura del tessuto cardiaco o la morte cellulare.
Queste tecniche consentono la valutazione della funzione cardiaca del pesce zebra e stabiliscono un fenotipo cardiaco nei modelli di malattie cardiache dei pesci zebra. Consente inoltre di testare nuovi farmaci, studiare le lesioni cardiache e la capacità rigenerativa. La tricaina MS-222 è irritante per la pelle, gli occhi e le vie respiratorie.
Quando si prepara la soluzione di tricaina, i dispositivi di protezione devono includere una maschera antipolvere, uno scudo per gli occhi e guanti.
