L'obiettivo generale di questo metodo è quello di indurre un linfedema secondario coerente nell'arto posteriore dei topi senza causare grave morbilità. Questo metodo può essere utilizzato per indurre un linfedema secondario nell'arto posteriore dei topi. Il vantaggio principale di questo metodo è che risolve un linfedema insignificante della durata di almeno otto settimane senza causare grave morbilità.
Qualcuno nuovo alla procedura può lottare con le tecniche microchirurgiche. Raccomandiamo quindi la formazione microchirurgica e diverse procedure pratiche per garantire un risultato positivo, ma anche per preparare il ricercatore in modo che possa eseguire la procedura in modo più efficiente. Impostare la sorgente di radiazioni e anestetizzare il mouse come descritto nel protocollo.
Posizionare un cuscinetto di piombo spesso 1,5 millimetri per assicurarsi che solo l'area sottoposta a intervento chirurgico venga irradiata. L'esempio mostrato è di un topo post-operatorio per chiarire l'area. Somministrare una dose di 10 irradiazioni grigie.
I ricercatori devono prendere precauzioni quando lavorano con le radiazioni. Durante questo esperimento tutta l'irradiazione è stata eseguita in una stanza isolata dalle radiazioni. E la sorgente di radiazioni è stata accesa solo quando tutto il personale aveva lasciato la stanza.
Pesare la pre-operazione del topo. Esaminare la profondità anestetica mediante test di avvicinamento delle zampe o della coda. Radere la gamba scelta per la procedura.
Impostare il flusso di ossigeno su 0,8 litri al minuto. Collegalo con un cono del naso. Applicare unguento oftalmico.
Iniettare 0,5 millilitri di soluzione salina per via sottocutanea, preferibilmente nello scruff del topo per prevenire l'ipovolemia durante l'intervento chirurgico. Posizionare il mouse sul panno chirurgico in posizione supina. Posizionare il cono del naso sopra il muso.
Fissare delicatamente l'estremità degli arti posteriori con il nastro adesivo, per evitare che il mouse si sposti durante l'intervento chirurgico. Sollevare la pelle con forcep lisce e ritagliare una piccola apertura di circa cinque millimetri prossimale alla fossa poplitea. Fai scorrere le forbici affilate nell'apertura e aggancia verso il ginocchio, in modo che l'incisione finisca appena sopra il ginocchio.
Assicurarsi di non forare i vasi sottostanti, sollevando la pelle con pini durante il ritaglio. Spostare il mouse in posizione prona e completare l'incisione circonferenziale. Sezionare la pelle a un paio di millimetri sopra l'angolo.
Ricorda di mantenere il tessuto umido con soluzione salina sterile durante l'intera procedura. Ritrarre la pelle del ferito prossimale con un retrattile elastico. E assicurati che la vena sciatica sia visibile come mostrato.
Iniettare 0,01 millilitri Patent Blue V per via sottocutanea tra il secondo e il terzo dito. Premere delicatamente la zampa un paio di volte per distribuire il Patent Blue V.La distribuzione del Patent Blue V può essere vista attraverso il microscopio. Le strutture da visualizzare sono, il vaso linfatico prossimale, PLV, il linfonodo popliteo, PLN, il primo vaso linfatico distale, DLV1, e il secondo vaso linfatico distale, DLV2.
Ingrandire per visualizzare il PLV e ligarlo utilizzando una sutura in nylon 10-0. Premere la zampa per assicurarsi che nessun patent blue passi prossimale alla legatura. Ligate i due vasi linfatici distale come mostrato.
Premere di nuovo la zampa più volte per assicurarsi che nessun Patent Blue V passi prossimale alla legatura. In questo esempio, si può vedere che uno dei vasi linfatici esplode a causa della legatura che ostacola il flusso linfatico. Rimuovere il linfonodo popliteo, il linfonodo ha una superficie liscia simile a una perla ed è colorato dal Patent Blue V in contrasto con il tessuto adiposo circostante.
Prima di rimuovere il cuscinetto di grasso inguinale, cauterizzare questo vaso come mostrato. Quindi rimuovere il fat pad in un unico pezzo. Assicurati che non ci sia sanguinamento attivo.
Questo è un esempio di linfonodo inguinale localizzato. Il linfonodo situato nel cuscinetto grasso inguinale è raramente colorato dal Patent Blue V e può essere difficile da differenziare dal grasso. Rimuovere il cuscinetto grasso in un unico pezzo è il modo migliore per garantire che il linfonodo sia stato rimosso.
Suturare i bordi della pelle fino alla fascia muscolare, con una sutura di nylon 6-0 usando pinza e porta ago, lasciando uno spazio da due a tre millimetri, per limitare il flusso linfatico superficiale. Questo è un esempio delle suture finite, nella fossa poplitea, nel lato laterale dell'arto posteriore, sopra il ginocchio e nel lato mediale dell'arto posteriore. Somministrare l'analgesia e pesare il topo dopo l'intervento chirurgico, quindi posizionare in un armadio riscaldato per il recupero.
Ripetere la procedura per l'irradiazione pre-chirurgica. Questo grafico mostra il volume medio combinato dell'arto posteriore di tre studi separati nelle otto settimane successive all'intervento chirurgico. 31 topi sono stati inclusi in totale.
L'asse x rappresenta settimane dopo l'intervento chirurgico. L'asse y rappresenta il volume dell'arto posteriore in millimetri cubi. Le barre freccia rappresentano la deviazione standard.
È da aspettarsi che il gonfiore dell'intervento chirurgico e il linfedema indotto diminuiscano durante le prime quattro settimane. Dopo le prime quattro settimane vediamo uno stato relativo stabile di linfedema. Il volume dell'arto posteriore di controllo aumenta durante le otto settimane, dicendo così rigorosamente la differenza di volume tra l'arto posteriore del linfedema e l'arto posteriore di controllo, questo è stato inaspettato.
Si ipotizza che i topi usino il loro ostacolo non operato più dell'arto posteriore operato nelle settimane successive all'intervento chirurgico. Questo potrebbe portare all'ipertrofia dell'ostacolo di controllo e forse spiegare l'aumento di volume. Per le singole cifre sui tre studi inclusi si prega di leggere il protocollo.
Questa tabella mostra il test di confronto multiplo di Sidak per le misurazioni combinate del volume dei tre studi inclusi. Il valore P calcolato mostra che esiste una differenza statisticamente significativa tra gli arti posteriori con linfedema indotto e gli arti posteriori di controllo, durante tutte e otto le settimane di follow-up. Per l'analisi statistica individuale sui tre progetti inclusi si prega di leggere il protocollo.
Questo metodo induce un linfedema statisticamente significativo, della durata di almeno otto settimane. La procedura può essere utilizzata per studiare la petrificialità del linfedema e per ricercare nuove opzioni di trattamento. Dopo aver visto questo video, dovresti aver acquisito una comprensione di come indurre il linfedema secondario nell'arto posteriore dei topi, usando una combinazione di microchirurgia e irradiazione pre e post-chirurgica.
Una volta padroneggiata, la procedura chirurgica può essere eseguita in 45 minuti.
