Questo metodo interrompe il flusso linfatico con danni minimi alle cellule endoteliali linfatiche e, con un controllo preciso dei tempi di blocco, può essere utilizzato per studiare come il flusso linfatico influisce sull'omeostasi e sulle risposte immunitarie nel linfonodo. Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà Jingna Xue, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per preparare un apparato di iniezione, tagliare circa 30 centimetri di tubi in polietilene.
Collegare la punta dell'ago A a un'estremità del tubo. Spostare con cura un altro ago e collegare il lato rotto all'altra estremità dei tubi in polietilene. Quindi attaccare l'ago A a una siringa tubercocina da un millilitro.
Immediatamente prima dell'uso, preparare una miscela 10:1 ketamina-xiazina in salina. Dopo aver anestetizzato il topo iniettando 250 microlitri della miscela chetamina/xiazina per via intraperitoneale, assicurarsi l'anestesia completa con un pizzico di dito. Radere la pelliccia intorno alle gambe con le tosaerba, quindi applicare la crema depilatoria intorno alla gamba.
Dopo cinque minuti, pulire la pelliccia residua e la crema depilatoria utilizzando un tessuto umido, quindi pulire la gamba con acqua sterile. Spruzzare il 70% di etanolo intorno alla gamba per sterilizzare l'area operativa. Posizionare il mouse in una posizione prona e utilizzare il nastro chirurgico per esporre l'area operativa sulla gamba destra.
Iniettare intradermally cinque microlitri di colorante blu 1%Evans o nove centimetri del fluido dall'apparato di iniezione che si inneggiano nel pedane destro del mouse. Massaggiare delicatamente il pedana per aiutare il fluido ad entrare nei vasi linfatici. Al microscopio sezionato, individuare un sito di incisione a cinque millimetri dal bordo inferiore della fossa poplitea.
Usando un paio di forbici, fai una piccola incisione lunga circa cinque millimetri. Quindi utilizzare forcep di funzionamento fine per allungare l'incisione ed esporre i vasi linfatici di raccolta. Identificare entrambi i vasi linfatici afferenti che portano ai linfonodi poplitei.
Utilizzando un portaaghi, inserire con cautela l'ago di sutura tra i vasi linfatici afferenti e l'arteria safenosa. Estrarre delicatamente l'ago intorno ai vasi linfatici afferenti. Tirare con cura la corda di sutura, lasciando dietro di sé circa due centimetri della corda di sutura.
Utilizzare il portaaghi per legare il nodo di un chirurgo. Massaggiare delicatamente il pedvio per assicurarsi che nessun colorante blu Evans passi il sito di sutura, quindi tagliare la corda in eccesso con le forbici. Sutura gli altri vasi linfatici afferenti, quindi chiudere l'incisione cutanea con la stessa sutura utilizzata per i vasi linfatici.
Per il controllo fittizio, iniettare intradermally cinque microlitri di colorante blu 1%Evans nel foot pad sinistro e massaggiare il foot pad. Aprire la pelle con un'incisione, quindi chiudere la ferita senza suturare il vaso. Quando si monitora il post-intervento chirurgico del mouse, la gamba destra dovrebbe mostrare edema, con la tintura blu Evans che si diffonde alla coscia, mentre la gamba di controllo mostrerà la tintura blu Evans limitata al foot pad.
Subito dopo l'intervento chirurgico, iniettare intradermally 10 microlitri del 2%FITC sia nel pedone destro che a sinistra. Due, sei e 12 ore dopo l'iniezione FITC, raccogliere i linfonodi poplitei dalla fossa dei topi eutanasiati. Rimuovere con cura il tessuto adiposo perinodale intorno ai pLAN.
Incorporare i pLAN in un composto ottimale della temperatura di taglio con l'area del seno midollare rivolta verso il lato dello stampo criogenico. Utilizzare un criotomo per preparare sezioni congelate da 20 micron. Per determinare la distribuzione FITC nei pLAN, immagini le crio-sezioni al microscopio confocale.
Le immagini confocali catturate due, sei e 12 ore dopo l'iniezione FITC mostrano un accumulo fitc sostanzialmente ridotto nei linfonodi poplitei dopo aver suturato i vasi linfatici afferenti. Il FITC residuo nei pLN è stato accumulato preferenzialmente nei seni linfonodi. Le immagini confocali del tessuto adiposo perinodale mostrano quando i vasi linfatici sono bloccati dalla sutura, il FITC entra nel tessuto quando il linfonodo sinusa, ma non è distribuito efficacemente in tutti i linfonodi.
Quando si tenta questo metodo, è importante ricordare che l'inserimento dell'ago di sutura tra il vaso sanguigno e il vaso linfatico è fondamentale. Il fallimento di questo passaggio può rompere le navi. Dopo aver eseguito questo metodo, è possibile immunizzare i topi con infezione o altra stimolazione immunitaria per studiare come il flusso linfatico regola la protezione immunitaria.
La funzione del flusso linfatico non è ben compresa. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le migrazioni cellulari nel linfonodo in assenza di flusso linfatico.
