Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla fondazione PhRMA e da un Research and Scholar Award dell'Università del Maryland, College Park. Ringraziamo il Prof. Darrell Irvine per il supporto del lavoro iniziale condotto nel completamento di"Ingegneria in situ del microambiente linfonodo tramite iniezione intranodale di particelle polimeriche che rilasciano coadiuvanti". 5 la commissione per i

Tutti gli studi sugli animali in questo protocollo sono stati completati in conformità con le linee guida federali, statali e locali e utilizzando protocolli esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Maryland.
1. Sintesi di micro e nanoparticelle stabilizzate dai lipidi
<ol><li>In una fiala di vetro da 7 ml, combinare lipidi DOPC, DSPE-PEG e DOTAP con un rapporto molare 60:20:20 per preparare un mix lipidico maestro.<ol>
<li>Per sintetizzare un singolo campione: Trasferire 242,9 μl, 287,4 μl e 71,9 μl, rispettivamente di DOPC, DSPE-PEG e DOTAP, nel flaconcino usando pipette sierologiche in vetro da 2 ml.</li>
		<li>Per sintetizzare più campioni: moltiplicare ogni volume lipidico sopra per il numero di campioni e combinarlo in un unico flaconcino, quindi trasferire aliquote uguali di questa miscela lipidica in flaconcini corrispondenti a ciascun campione da preparare.</li>
		<li>Lipidi secchi sotto un flusso delicato di gas azoto per 10 minuti o posizionare nel forno sottovuoto durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In un unico flaconcino di vetro vuoto da 20 ml sciogliere 80 mg di PLGA in 5 ml di diclorometano per ogni campione di particelle per generare una soluzione di stock polimerico da 16 mg/ml.</li>
	<li>Aggiungere 5 ml di soluzione polimerica al flaconcino o ai flaconcino contenenti i lipidi secchi, il cappuccio e il vortice per 30 secondi.</li>
	<li>Per sintetizzare microparticelle:<ol>
<li>Inizia a sonicare la fase organica contenente il polimero, i lipidi e altri carichi insolubili in acqua sul ghiaccio a 12 W usando un sonicatore.</li>
		<li>Creare l'emulsione acqua-in-olio (w/o) utilizzando una pipetta per aggiungere 500 μl di H2O distillato, o H2O contenente 1 mg di peptide, proteine o altro carico solubile in acqua.</li>
		<li>Continuare a sonicare per 30 secondi a 12 W sul ghiaccio, dondolando delicatamente il flaconcino su e giù e da un lato all'altro intorno alla punta del sonicatore per garantire una completa emulsione.</li>
		<li>Creare l'emulsione acqua-in-olio in acqua (w/o/w) versando l'emulsione w/o in 40 ml di H2O in un bicchiere da 150 ml.</li>
		<li>Omogeneizzare per 3 minuti a 16.000 giri/min utilizzando un omogeneizzatore digitale.</li>
		<li>Aggiungere una barra di agitazione magnetica, trasferire il becher su una piastra di agitazione e lasciare che l'emulsione w/o/w si mescola durante la notte per rimuovere il solvente in eccesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per sintetizzare le nanoparticelle:<ol>
<li>Inizia a sonicare la fase organica contenente il polimero, i lipidi e altri carichi insolubili d'acqua sul ghiaccio a 14 W.</li>
		<li>Creare l'emulsione w/o utilizzando una pipetta per aggiungere 500 μl di H2O distillato o H2O contenente 1 mg di peptide, proteine o altro carico solubile in acqua.</li>
		<li>Continuare a sonicare per 30 secondi a 14 W sul ghiaccio.</li>
		<li>Creare l'emulsione w/o/w versando l'emulsione w/o a 40 ml di H2O in un bicchiere da 150 ml e sonicando per 5 minuti a 16 W sul ghiaccio. Scuotere delicatamente il flaconcino su e giù e da un lato all'altro intorno alla punta del sonicatore per garantire una completa emulsione.</li>
		<li>Aggiungere una barra di agitazione magnetica, trasferire il pallone su una piastra di agitazione e lasciare che l'emulsione w/o/w si mescola durante la notte per rimuovere il solvente in eccesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La mattina dopo, lavare e raccogliere particelle:<ol>
<li>Versare l'emulsione attraverso un filtro cellulare in rete di nylon da 40 μm in un tubo conico da 50 ml.</li>
		<li>Particelle di centrifuga per 5 min a 5.000 x g per le microparticelle o 5 min a 24.000 x g per le nanoparticelle.</li>
		<li>Decantare le particelle supernatanti e lavate rimontendo in 1 ml di H2O.</li>
		<li>Trasferire particelle sospese in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.</li>
		<li>Centrifuga per 5 min a 5.000 x g per le microparticelle o 5 min a 24.500 x g per le nanoparticelle.</li>
		<li>Lavare le particelle altre due volte rimuovendo il supernatante, rimescolando in 1 ml H2O e centrifugando come nel passaggio 1.6.5. Dopo il lavaggio, sospendere le particelle in 1 ml H2O per un uso immediato o liofilizzare per una conservazione estesa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Misurazione della resa di sintesi
<ol><li>Preweighare una fiala di vetro vuota da 20 ml. Aggiungere 100 μl di sospensione delle particelle al flaconcino preweighed dopo aver pipettato su e giù con una micropipetta da mescolare.</li>
	<li>Lyophilize le particelle o asciugare sotto un dolce flusso di azoto.</li>
	<li>Pesare la fiala contenente il polimero essiccato. Determinare la resa delle particelle nel flaconcino sottraendo il peso originale del flaconcino dalla massa del flaconcino contenente le particelle essiccate.</li>
	<li>Determinare la resa complessiva delle particelle moltiplicando la massa delle particelle nel flaconcino per il fattore di diluizione. Per determinare la resa percentuale, dividere la massa delle particelle per la massa di input teorica massima e moltiplicare per il 100%.</li>
</ol>3. Determinazione della dimensione delle particelle
<ol><li>Pulire la cella di frazione di vetro in dotazione in stile cuvette riempiendosi con acqua deionizzata e pulendo con tampone con punta di cotone. Trasferire 10 ml di H2O distillato alla cella di fazione pulita, aggiungere la barra magnetica di micro agitazione e caricare la cella di frazione nel supporto cellulare dell'analizzatore di dimensioni delle particelle.</li>
	<li>Regolare la velocità di agitazione magnetica nell'analizzatore di particelle per ottenere una miscelazione completa nella cella di frazione e chiudere la porta del vano.</li>
	<li>Allineare i laser alla cella di frazione utilizzando l'interfaccia software dello strumento.</li>
	<li>Utilizzare l'interfaccia software dello strumento per registrare una lettura di base con la cella di frazione contenente solo H2O distillato.</li>
	<li>Pipettare la sospensione originale delle particelle su e giù con una micropipetta da mescolare.</li>
	<li>Pipetta 10 μl di sospensione delle particelle (tipicamente circa 0,5 mg) nella cella frazionale. Assicurarsi che il volume del campione di particelle aggiunto alla cella sia sufficiente a generare la potenza del segnale nell'intervallo appropriato come indicato sull'interfaccia software dello strumento. La massa effettiva delle particelle richieste dipende dalla resa percentuale e dalle proprietà ottiche del campione di particelle.</li>
	<li>Chiudere la porta del compartimento dell'analizzatore di dimensioni delle particelle e misurare la dimensione delle particelle utilizzando un indice di rifrazione di 1,60 per PLGA.</li>
	<li>Utilizzare l'interfaccia software per calcolare il diametro delle particelle utilizzando una base numerica.</li>
</ol>4. Visualizzazione delle particelle
<ol><li>Sospensione delle particelle pipetta su e giù con micropipetta da mescolare. Diluire la sospensione delle particelle a 1 mg/ml in acqua deionizzata.</li>
	<li>Preparare uno scivolo al microscopio aggiungendo 3 μl di sospensione di particelle diluite e montando un coverslip con un angolo di 45 ° per evitare la formazione di bolle. Posizionare la diapositiva sullo stadio del microscopio e sull'immagine utilizzando i set di filtri appropriati per ogni carico fluorescente.</li>
</ol>5. Preparazione di topi per i.LN. iniezione
<ol><li>Preparare la soluzione di colorante tracciante:<ol>
<li>Preparare una soluzione dello 0,1% (w/v) di colorante tracciante sciogliendo 10 mg di polvere colorante con 10 ml di H2O distillato.</li>
		<li>Sterilizzare la soluzione colorante in una fiala di vetro utilizzando un filtro siringa da 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Un giorno prima dell'iniezione, anestetizzare il topo usando isoflurane secondo un protocollo animale approvato dalla IACUC. Per valutare la profondità dell'anestesia, eseguire un test riflesso del dito del dito del giorno e monitorare la frequenza respiratoria per garantire una frequenza respiratoria di circa 100-140 respiri al minuto.</li>
	<li>Radere i capelli alla base della coda e del quarto posteriore usando i tosatrici mentre il topo viene anestetizzato. Rimuovere i capelli dal lato ventrale dell'animale e lateralmente intorno al lato dorsale appena sopra l'articolazione della gamba posteriore (anca).</li>
	<li>Iniettare colorante tracciante.<ol>
<li>Per ogni iniezione di colorante, utilizzare una micropipetta per trasferire 10 μl di soluzione colorante in un tubo di microcentrifugo e aspirare l'intero 10 μl in un ago 31G attaccato a una siringa da 1 ml.</li>
		<li>Iniettare 10 μl di soluzione colorante per via sottocutanea su ciascun lato della base della coda in cui i capelli sono stati tagliati, ricaricandosi tra un'iniezione e l'altra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere i capelli rimanenti applicando una leggera crema depilatoria tramite tamponi di cotone. Assicurati di rivestire l'area tra la coscia posteriore e l'addome.</li>
	<li>Lasciare incubare la crema depilatoria sulla pelle per 3 minuti. Dopo l'incubazione, mano guantata bagnata con H2O calda e strofinare delicatamente la crema depilatoria nella pelle.</li>
	<li>Rimuovere immediatamente la crema depilatoria bagnando la mano guantata con H2O calda e strofinando la base della coda e il quarto posteriore. Ripetere fino a quando l'eccesso di depilatorio viene rimosso, assicurandosi di tenere la mano bagnata per evitare irritazioni.</li>
	<li>Rimuovere lo spilatorio residuo dal mouse bagnando un panno morbido o un tovagliolo di carta con H2O caldo e in un unico movimento, pulendo la parte inferiore del mouse. Evitare un movimento di sfregamento per prevenire abrasioni o danni alla pelle al mouse.</li>
	<li>Lasciare che il mouse si riprenda sotto una lampada termica e ritorni a tenere.</li>
</ol>6. i.LN. Iniezione di particelle
<ol><li>Il giorno seguente, anestetizza il topo usando l'isoflurane secondo un protocollo animale approvato dalla IACUC.</li>
	<li>Esaminare il mouse per confermare il drenaggio del colorante tracciante in ogni linfonodo inguinale. Il linfonodo dovrebbe essere visibile come una macchia scura vicino alla coscia posteriore e all'addome.</li>
	<li>Preparare la soluzione di iniezione di particelle:<ol>
<li>Particelle di resuspend in H 2 Odistillatoalla concentrazione di iniezione desiderata. Per ogni iniezione, utilizzare una micropipetta per trasferire 10 μl di soluzione particellare in un tubo di microcentrifugo.</li>
		<li>Aspirare l'intero 10 μl in un ago di insulina 31G attaccato a una siringa da 1 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniettare la dose di particelle:<ol>
<li>Dopo aver visualizzato LN, stringere la pelle intorno a LN usando pollice, indice e dito medio per tirare la provocazione della pelle e consentire il posizionamento controllato del volume di iniezione.</li>
		<li>Avvicinati all'LN con l'ago con un angolo di 90° rispetto alla pelle e penetra la pelle sopra l'LN tinto a una profondità di 1 mm.</li>
		<li>Iniettare lentamente l'intero volume. Durante l'iniezione, osservare il volume LN attraverso la pelle per confermare l'iniezione mediante ingrandimento visibile della LN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Consentire al mouse di recuperare sotto una lampada termica e tornare a tenere o condurre ulteriori test.</li>
</ol>Per le tecniche di analisipertinenti (ad esempio istologia, citometria del flusso) si vedano gli articoli 265, 1743 e 3054 e i protocolli attuali in immunologia, capitoli 5 e 2115-22.

<ol>
	<li>Swartz, M. A., Hirosue, S., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Approaches+to+Immunotherapy.">Engineering Approaches to Immunotherapy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Adamina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranodal+immunization+with+a+vaccinia+virus+encoding+multiple+antigenic+epitopes+and+costimulatory+molecules+in+metastatic+melanoma.">Intranodal immunization with a vaccinia virus encoding multiple antigenic epitopes and costimulatory molecules in metastatic melanoma.</a> Mol. Ther. 18, 651-659 (2010).</li><li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-Lymph+Node+Prime-Boost+Vaccination+against+Melan+A+and+Tyrosinase+for+the+Treatment+of+Metastatic+Melanoma:+Results+of+a+Phase+1.">Intra-Lymph Node Prime-Boost Vaccination against Melan A and Tyrosinase for the Treatment of Metastatic Melanoma: Results of a Phase 1.</a> Clinical Trial. Clin. Cancer Res. 17, 2987-2996 (2011).</li><li>Senti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+allergen+administration+renders+specific+immunotherapy+faster+and+safer:+a+randomized+controlled+trial.">Intralymphatic allergen administration renders specific immunotherapy faster and safer: a randomized controlled trial.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 17908-17912 (2008).</li><li>Jewell, C. M., Lopez, S. C. B., Irvine, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+engineering+of+the+lymph+node+microenvironment+via+intranodal+injection+of+adjuvant-releasing+polymer+particles.">In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15745-15750 (2011).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+kinetics+determines+immune+reactivity.">Antigen kinetics determines immune reactivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5189-5194 (2008).</li><li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels.">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 617-628 (2005).</li><li>Irvine, D. J., Jewell, C. M., Ducheyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+132.">Ch. 132.</a> Comprehensive Biomaterials. , (2011).</li><li>Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Nano-+and+Microparticles+to+Tune+Immunity.">Engineering Nano- and Microparticles to Tune Immunity.</a> Adv. Mater. 24, 3724-3746 (2012).</li><li>Reddy, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+lymphatic+transport+and+complement+activation+in+nanoparticle+vaccines.">Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines.</a> Tissue Eng. Part A. 14, 734-735 (2008).</li><li>Bershteyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-supported+lipid+shells,+onions,+and+flowers.">Polymer-supported lipid shells, onions, and flowers.</a> Soft Matter. 4, 1787-1791 (2008).</li><li>Johansen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intralymphatic+injection+of+peptide+vaccines+enhances+immunogenicity.">Direct intralymphatic injection of peptide vaccines enhances immunogenicity.</a> Eur. J. Immunol. 35, 568-574 (2005).</li><li>Mohanan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+routes+affect+the+quality+of+immune+responses:+A+cross-sectional+evaluation+of+particulate+antigen-delivery+systems.">Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems.</a> J. Controlled Release. 147, 342-349 (2010).</li><li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+mapping+in+the+mouse.">Lymph node mapping in the mouse.</a> J. Immunol. Methods. 332, 170-174 (2008).</li><li>He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Flow+Cytometry+Analyses+of+Cellular+Immune+Response+in+Rhesus+Macaques.">Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques.</a> J. Vis. Exp. , 1743 (2010).</li><li>Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+2-Photon+Imaging+of+Peripheral+Lymph+Nodes+in+Mice.">Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice.</a> J. Vis. Exp. e265. , 265 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Imaging+of+T+Cells+in+Murine+Lymph+Node+Slices+with+Widefield+and+Confocal+Microscopes.">Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes.</a> J. Vis. Exp. , 3054 (2011).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Immunofluorescence Staining. , (2001).</li><li>Hofman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Immunohistochemistry. , (2001).</li><li>Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Preparation of Cells and Reagents for Flow Cytometry. , (2001).</li><li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Overview of Flow Cytometry. , (2001).</li><li>Sharrow, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Current Protocols in Immunology: Analysis of Flow Cytometry Data. , (2001).</li><li>Anderson, J. M., Shive, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+and+biocompatibility+of+PLA+and+PLGA+microspheres.">Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).</li><li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLGA-based+nanoparticles:+an+overview+of+biomedical+applications.">PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.</a> J. Controlled Release. 161, 505-522 (2012).</li></ol>

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La tecnica descritta in questo protocollo consente la consegna controllata di vaccini alle LN e alle cellule di presentazione dell'antigene residente in LN. Il carico incapsulato di biomateriale può essere localizzato all'interno della LN, consentendo la manipolazione delle dosi di uno o più tipi di carico consegnate al microambiente LN. La localizzazione e il rilascio controllato da particelle polimeriche ha dimostrato di generare una potente risposta immunitaria cellulare e umorista a dosi significativamente inferiori rispetto agli approcci convenzionali. Inoltre, attraverso la manipolazione delle dimensioni del vettore di biomateriali, la modalità primaria di elaborazione cellulare può essere modulata tra l'assorbimento diretto di nanoparticelle o il rilascio di carichi extracellulari da microparticellepiù grandi 5. Questi risultati stabiliscono la fattibilità della somministrazione di biomateriali i.LN. come piattaforma per la somministrazione di vaccini terapeutici.
La sintesi delle particelle PLGA per evaporazione emulsione/solvente è stata ampiamente utilizzata nelle applicazioni disomministrazione di farmaci 23,24. Pertanto, le potenziali sfide associate a questa tecnica riguardano principalmente l'identificazione e la deposizione di vaccini di successo nel sito target della LN. Sebbene l'uso del colorante tracciante faciliti la visualizzazione delle LN inguinali mirate, le dimensioni e la profondità target sotto la pelle sono piccole. Pertanto, gli autori raccomandano di assegnare tempo e topi per praticare la preparazione e le iniezioni di topi. Durante la preparazione animale (cioè la rasatura e l'applicazione di depilatori), si deve fare attenzione a non tagliare i topi sul lato ventraledell'animale dove l'angolo della gamba con l'addome rende la pelle più soggetta a lesioni da tosaerba. Inoltre, tutti i depilatori devono essere rimossi con acqua tiepida per impedire agli animali di ingerire la crema durante il normale comportamento di toelettatura. Per praticare le iniezioni di LN, è possibile somministrata una maggiore concentrazione di coloranti traccianti e praticare gli animali, e quindi iniettati più volte. Dopo iniezione i topi possono essere necropificati e le dimensioni delle LN degli animali iniettati possono essere confrontate con un LN di controllo non iniettato. Una limitazione di questa tecnica è il limite fisico del volume di iniezione che può essere caricato nella struttura LN. Il nostro protocollo suggerisce un volume di iniezione di 10 μl nei topi, anche se altri studi hanno riportato volumi di iniezione maggiori almeno fino a 20 μl.13 Tuttavia, la somministrazione diretta di vaccini tramite iniezione i.LN. consente un drastico risparmio di dose, quindi la funzione di questi vaccini non dovrebbe generalmente essere limitata da vincoli di volume.
Come notato, cambiare la proprietà fisicadelle particelle (cioè le dimensioni) è un meccanismo efficace per alterare la via o i risultati indotti dai biomateriali e dai carichi incapsulati nel tessuto LN. Il protocollo di evaporazione emulsione/solvente può essere facilmente modificato per alterare proprietà fisiche o chimiche come la carica o la funzionalità della superficie e la velocità di biodegradazione / rilascio delcarico 23,24. Ad esempio, la cinetica di rilascio può essere sintonizzata attraverso composizioni polimeriche alternative e la funzione superficiale può essere modificata utilizzando composizioni lipidiche modificate o poly (alcol vinilico). Il carico caricato in particelle può essere facilmente manipolato per contenere diversi antigeni o coadiuvanti per agenti patogeni bersaglio. Il vantaggio di questo approccio si ottiene attraverso la combinazione della consegna i.LN. con il rilascio locale e controllato di merci da biomateriali. Questa sinergia stabilisce una piattaforma che può essere sfruttata per generare in modo efficiente risposte immunitarie adattive utilizzando dosi minute e con effetti collaterali non specifici / sistemici ridotti.

I linfonodi (LN) sono i centri di comando del sistema immunitario. In questo sito immunologico, l'antigene che presenta le cellule primi linfociti ingenui contro specifici antigeni estranei per attivare risposte immunitarie cellulari e umoriali. Le LN sono quindi diventate un obiettivo attraente per la somministrazione di vaccini e immunoterapie. Sfortunatamente, la maggior parte delle strategie vaccinale si traducono in una consegna inefficiente e transitoria di antigene e coadiuvanti al tessuto linfoide1. Approcci che migliorino l'individuazione e la conservazione dei componenti dei vaccini nelle LN potrebbero quindi avere un impatto significativo sulla potenza e sull'efficienza dei nuovi vaccini.
Una strategia per aggirare la sfida del targeting LN che ha dimostrato grande interesse per i nuovi studi clinici è l'iniezione diretta, intra-LN (i.LN.)2-4. Questi studi hanno utilizzato la guida ecografico per fornire vaccini alle LN come semplice procedura ambulatoriale. Rispetto alle tradizionali vie di iniezione periferica, questo approccio ha portato a un significativo risparmio di dose e a una migliore efficacia in contesti terapeutici tra cui allergie ecancro 2-4. Questi studi hanno impiegato l'iniezione di vaccini solubili (cioè senza biomateriali)che sono stati rapidamente cancellati dal drenaggio linfatico. Pertanto, sono state somministrate iniezioni multiple o cicli di iniezioni multiple per ottenere questi impressionanti effetti terapeutici. Una migliore ritenzione nella LN potrebbe migliorare l'interazione tra antigene e/o adiuvante e cellule immunitarie, migliorando ulteriormente la potenza dell'adescamento delle cellule immunitarie. Questo potenziale è supportato da recenti studi che mostrano che la cinetica dell'antigene e del parto adiuvante gioca un ruolo fondamentale nel determinare la rispostaimmunitaria specifica generata 5-7. Inoltre, localizzare e ridurre al minimo le dosi di farmaci e vaccini potrebbe ridurre o eliminare gli effetti sistemici, come l'infiammazione cronica.
I biomateriali sono stati ampiamente studiati per migliorare la potenza e l'efficienza deivaccini 1,8,9. L'incapsulamento o l'adsorbimento sui trasportatori di biomateriali può proteggere fisicamente il carico dalla degradazione e superare i limiti di solubilità. Un'altra caratteristica degna di nota dei portatori di biomateriali, come micro o nanoparticelle polimeriche, è la capacità di coricarsi diverse classi di carico e, successivamente, rilasciare questi carichi a intervalli controllati. Tuttavia, una limitazione significativa che continua a ostacolare i vaccini biomateriali e le immunoterapie in vivo è il targeting inefficiente delle cellule immunitarie e il traffico limitato ai linfonodi. Ad esempio, l'iniezione periferica di vaccinibiomateriali attraverso percorsi convenzionali (ad esempio intradermico, intramuscolare) presenta in genere un cattivo targeting LN, con fino al 99% del materiale iniettato rimasto nel sito diiniezione 4,10. Più recentemente, le dimensioni dei portatori di vaccini biomateriali sono state ottimizzate per migliorare il traffico preferenziale o il drenaggio di questi vaccini verso le LN attraverso il flusso interstiziale8,10. Questi progressi hanno portato a maggiori risposte immunitarie cellulari e umoristico, sottoscrivendo l'importanza di indirizzare e progettare l'ambiente LN per nuovi vaccini.
Questo documento presenta un protocollo di vaccinazione che combina particelle polimeriche stabilizzate dai lipidi e consegna i.LN. per generare depositi di vaccini arilascio controllato 5,11. Sulla base di recenti studi che utilizzano tecniche chirurgiche per i.LN. neitopi 6,7,12,13, abbiamo sviluppato una strategia rapida e non chirurgica per iniettare vaccini biomateriali in piccoli animali5. Combinando la somministrazione di i.LN. con portatori di vaccini biomateriali, la risposta cellulare CD8 T è migliorata in modo potente entro 7 giorni dopo una singola iniezione di depositi di vaccini arilascio controllato 5. È stata generata anche unaforte risposta umorista (cioè tatri anticorpali); entrambi i miglioramenti erano legati ad una maggiore ritenzione di componenti del vaccino nei linfonodi che è stata mediata dal rilascio controllato dai portatori di biomateriali. È interessante notare che le dimensioni delle particelle vaccino hanno alterato il destino di questi materiali una volta nelle LN: le particelle su scala nanometrica hanno mostrato un maggiore assorbimento diretto da parte delle cellule, mentre microparticelle più grandi sono rimaste nell'ambiente LN extracellulare e hanno rilasciato carichi(ad esempio coadiuvanti) che sono stati ripresi dall'antigene residente nella LN che presentale cellule 5. Questi dati suggeriscono due percorsi che potrebbero essere sfruttati per nuovi vaccini controllando le dimensioni dei biomateriali iniettati i.LN.
In questo articolo le particelle polimeriche biodegradabili stabilizzate dai lipidi (micro e nanoscala) vengono sintetizzati utilizzando una strategia di doppiaemulsione modificata 5,11. Le proprietà delle particelle sono caratterizzate da diffrazione laser e microscopia. Queste particelle vengono quindi iniettate direttamente nelle LN inguinali identificate non chirurgicamente utilizzando un comune colorante tracciante non tossico14. L'analisi post-iniezione delle LN mediante istologia o citometria del flusso può essere utilizzata per verificare la distribuzione delle particelle all'interno dell'ambiente LN, nonché per monitorare l'assorbimento cellulare e la ritenzione di particelle nel tempo. Per i protocolli che descrivono in dettaglio l'elaborazione istologica e la citometria del flusso, i lettori sono riferiti ai recenti articoli jove e alle relazionidi giornale 15-22. I risultati tipici dimostrano il targeting locale di LN di questi depositi che potrebbero essere sfruttati per ottenere risposte immunitarie potenti ed efficienti o per personalizzare l'immunità per gli agenti patogeni bersaglio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850375</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880128</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2191</td>
			<td style="width:167px;">Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dichloromethane (DCM)</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH1113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:71px;">Vetone</td>
			<td style="width:119px;">502017</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair</td>
			<td style="width:71px;">Nair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Evans blue tracer dye</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">AAA16774-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD328418</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305167</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD309628</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-949</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vybrant DiD Cell-Labeling Solution</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17149</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17156</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ovalbumin, Purified</td>
			<td style="width:71px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LS003056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125</td>
			<td style="width:71px;">Qsonica</td>
			<td style="width:119px;">Q125</td>
			<td style="width:167px;">1/8 in diameter microtip probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">YO-04739-22</td>
			<td style="width:167px;">10 G dispersing element</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX-83</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer</td>
			<td style="width:71px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">LA-950</td>
			<td style="width:167px;">Including provided cuvette-style glass fraction cell</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Professional 8685 Peanut Classic Clippers</td>
			<td style="width:71px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-lymph node injection of biodegradable polymer particles

La generazione di risposta immunitaria adattiva si basa su un efficiente drenaggio o traffico di antigene ai linfonodi per la lavorazione e la presentazione di queste molecole estranee ai linfociti T e B. I linfonodi sono quindi diventati obiettivi critici per nuovi vaccini e immunoterapie. Una strategia recente per colpire questi tessuti è l'iniezione diretta di linfonodi di componenti del vaccino solubili, e gli studi clinici che coinvolgono questa tecnica sono stati promettenti. Sono state inoltre studiate diverse strategie di biomateriale per migliorare il targeting dei linfonodi, ad esempio la messa a punto delle dimensioni delle particelle per un drenaggio ottimale delle particelle del vaccino contro i biomateriali. In questo articolo presentiamo un nuovo metodo che combina l'iniezione diretta di linfonodi con particelle polimeriche biodegradabili che possono essere cariche di antigene, coadiuvante o altri componenti del vaccino. In questo metodo le microparticelle polimeriche o le nanoparticelle sono sintetizzati da un protocollo di doppia emulsione modificato che incorpora stabilizzatori lipidici. Le proprietà delleparticelle (ad esempio dimensioni, carico del carico) sono confermate rispettivamente dalla diffrazione laser e dalla microscopia fluorescente. I linfonodi del topo vengono quindi identificati mediante iniezione periferica di un colorante tracciante non tossico che consente la visualizzazione del sito di iniezione bersaglio e la successiva deposizione di particelle polimeriche nei linfonodi. Questa tecnica consente il controllo diretto sulle dosi e le combinazioni di biomateriali e componenti vaccinale consegnati ai linfonodi e potrebbe essere sfruttata nello sviluppo di nuovi vaccini a base di biomateriali.

I risultati attesi per i protocolli presentati in questo manoscritto possono essere suddivisi in tre categorie: sintesi delle particelle, preparazione animale e iniezione di particelle.
La figura 1 descrive la sintesi e la caratterizzazione delle particelle polimeriche biodegradabili, stabilizzate dai lipidi anfifili. I risultati del protocollo di sintesi dell'evaporazione emulsione/solvente(figura 1A)possono essere valutati qualitativamente mediante ispezione visiva delle emulsioni finali generate; i lotti di particelle devono essere emulsioni omogenee e stabili con un aspetto opaco. Le complicazioni includono emulsioni che cremano o flocculate, spesso a causa di una conservazione impropria degli stabilizzatori lipidici. Per evitare questa instabilità, i lipidi devono essere conservati a -80 °C in uno stato disidratato o in una fiala sigillata spurgata con azoto. La valutazione quantitativa della sintesi delle particelle può essere eseguita utilizzando la diffrazione laser o lo scattering dinamico della luce per analizzare la distribuzione delle dimensioni (Figura 1B). I risultati attesi includono particelle monomodali strettamente distribuite, che indicano una popolazione uniforme di particelle. I parametri di sintesi descritti in questo manoscritto generano distribuzioni medie numerate centrate rispettivamente a circa 100 nm o 3 μm per nanoparticelle e microparticelle. Un'ulteriore valutazione qualitativa della sintesi delle particelle può essere ottenuta attraverso la modifica del protocollo di cui sopra per incorporare più classi di carico fluorescente. Nella figura 1C, le immagini al microscopio di microparticelle cariche di un peptide fluorescente (FITC, verde), un colorante lipofilo (DiD, rosso) e un'immagine sovrapposta (gialla) confermano la creazione di particelle entro l'intervallo di dimensioni desiderato e l'incapsulamento del peptide all'interno del volume della particella.
I primi due gruppi della figura 2 riassumono i risultati attesi della preparazione animale per la strategia di iniezione i.LN. descritta in questo documento. La metodologia prevede la marcatura delle LN inguinali mediante iniezione periferica di un tracciante non tossico per identificare la posizione per la successiva iniezione di particelle ( Figura2A)5. Come notato, il drenaggio del colorante tracciante a seguito dell'iniezione sottocutanea alla base della coda consentirà la visualizzazione delle LN inguinali (Figura 2B)5. L'ingestione di creme depilatorie approvate può rappresentare un pericolo per i topi. Pertanto, si dovrebbe fare attenzione a rimuovere completamente tutta la crema applicata, prestando particolare attenzione alle zampe e al lato ventrale dei topi. La depilatoria deve essere rimossa utilizzando un panno bagnato e morbido o un tovagliolo di carta bagnato in un unico movimento liscio. Evitare lo sfregamento per rimuovere la crema, in quanto ciò può portare ad abrasioni sulla pelle esposta dei topi.
La conferma del locale di consegna alla LN inguinale può essere valutata attraverso l'osservazione o l'istologia. Il volume LN può essere monitorato visivamente durante l'iniezione come indicatore di iniezione riuscita. I risultati attesi includono un'efficiente distribuzione del carico in tutta la struttura LN, senza perdite significative ai tessuti o alle cellule adiacenti. Inoltre, man mano che il fluido iniettato sposta/diluisce il tracciante nella LN, la concentrazione/colorazione del colorante dovrebbe diventare meno intensa dopo l'iniezione. L'osservazione del tessuto dovrebbe rivelare una LN intatta, ma ingrandita a causa dell'iniezione di liquidi. Le potenziali sfide includono l'iniezione troppo rapidamente o la mancanza della LN, che possono causare l'eluizione del volume nel tessuto sottocutaneo circostante. Questi esiti indesiderati possono essere confermati dalla necroscopia o dall'istologia, dove la sospensione delle particelle sarà osservata diffondersi a cellule e tessuti remoti da nodi mirati all'iniezione. Al contrario, un risultato atteso sarebbe l'identificazione di un LN inguinale allargato a causa del contenimento delle particelle all'interno della struttura LN. Il trattamento istologico delle LN asportate può confermare definitivamente la consegna del carico al tessuto linfoide, come mostrato nelle figure 2C e 2D. Si noti che le particelle nella figura 2 incorporano il carico fluorescente per consentire la visualizzazione del carico durante l'iniezione, nonché durante l'elaborazione istologica e la microscopia fluorescente.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig1.jpg" width="600px"> Figura 1. Sintesi e caratterizzazione delle particelle lipidiche stabilizzate. A) Schema che descrive la sintesi delle particelle stabilizzate dai lipidi preparate per evaporazione emulsione/solvente. B) Distribuzioni di dimensioni di microparticelle (linea solida, diametro = 2,8 μm) e nanoparticelle (linea tratteggiata, diametro = 113 nm). C)Immagini in microscopia fluorescente di particelle cariche di peptide con etichetta fluorescente e un colorante di particelle fluorescenti. Etichette: peptide (verde) e particella (rosso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig2.jpg" width="600px"> Figura 2. I.LN. Iniezione e distribuzione di particelle biodegradabili all'interno di LN. A) Metodologia per iniezione i.LN. B) Visualizzazione delle LN in un mouse attraverso la pelle (immagine superiore) e successiva necroscopia (immagine inferiore)5. C)Colorazione istologica di una LN che conferma la deposizione e la distribuzione di microparticelle polimeriche fluorescenti (particelle, verde; T-cellule, rosso; Cellule B, blu). D)Nanoparticelle con etichetta fluorescente (50 nm, immagine sinistra) e microparticelle (6 μm, immagine destra) nelle LN 24 ore dopo l'iniezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.

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Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

I linfonodi sono i tessuti immunologici che orchestrano la risposta immunitaria e sono un obiettivo critico per i vaccini. I biomateriali sono stati impiegati per colpire meglio i linfonodi e per controllare la consegna di antigeni o coadiuvanti. Questo articolo descrive una tecnica che combina queste idee per iniettare particelle polimeriche biocompatibili nei linfonodi.

Iniezione intra-linfonodo di particelle polimeriche biodegradabili

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

intra-lymph-node-injection-of-biodegradable-polymer-particles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.3K Views.  University of Maryland, College Park. I linfonodi sono i tessuti immunologici che orchestrano la risposta immunitaria e sono un obiettivo critico per i vaccini. I biomateriali sono stati impiegati per colpire meglio i linfonodi e per controllare la consegna di antigeni o coadiuvanti. Questo articolo descrive una tecnica che combina queste idee per iniettare particelle polimeriche biocompatibili nei linfonodi.

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A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Un Microfluidic basato Trappola idrodinamico per particelle singole

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A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures can act as a nidus for infection and in many procedures are unable to effect wound repair or interfere with functional tissue regeneration.1 Surgical glues and adhesives, such as those based on fibrin and cyanoacrylates, have been developed as alternatives to sutures for the repair of such wounds. However, current commercial adhesives also have significant disadvantages, ranging from viral and prion transfer and a lack of repair strength as with the fibrin glues, to tissue toxicity and a lack of biocompatibility for the cyanoacrylate based adhesives. Furthermore, currently available surgical adhesives tend to be gel-based and can have extended curing times which limit their application.2 Similarly, the use of UV lasers to facilitate cross-linking mechanisms in protein-based or albumin 'solders' can lead to DNA damage while laser tissue welding (LTW) predisposes thermal damage to tissues.3 Despite their disadvantages, adhesives and LTW have captured approximately 30% of the wound closure market reported to be in excess of US $5 billion per annum, a significant testament to the need for sutureless technology.4
In the pursuit of sutureless technology we have utilized chitosan as a biomaterial for the development of a flexible, thin film, laser-activated surgical adhesive termed 'SurgiLux'. This novel bioadhesive uses a unique combination of biomaterials and photonics that are FDA approved and successfully used in a variety of biomedical applications and products. SurgiLux overcomes all the disadvantages associated with sutures and current surgical adhesives (see Table 1).
In this presentation we report the relatively simple protocol for the fabrication of SurgiLux and demonstrate its laser activation and tissue weld strength. SurgiLux films adhere to collagenous tissue without chemical modification such as cross-linking and through irradiation using a comparatively low-powered (120 mW) infrared laser instead of UV light. Chitosan films have a natural but weak adhesive attraction to collagen (~3 KPa), laser activation of the chitosan based SurgiLux films emphasizes the strength of this adhesion through polymer chain interactions as a consequence of transient thermal expansion.5 Without this 'activation' process, SurgiLux films are readily removed.6-9 SurgiLux has been tested both in vitro and in vivo on a variety of tissues including nerve, intestine, dura mater and cornea. In all cases it demonstrated good biocompatibility and negligible thermal damage as a consequence of irradiation.6-10

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, &#039;SurgiLux&#039;: Preparation and Demonstration

The fabrication of a novel, flexible thin film surgical adhesive from FDA approved ingredients, chitosan and indocyanine green is described. Bonding of this adhesive to collagenous tissue through a simple activation process with a low-powered infra-red laser is demonstrated.

Un Based Chitosano, Laser attivato sottile pellicola adesiva chirurgici, &#39;SURGILUX&#39;: Preparazione e dimostrazione

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Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays polimerici per Discovery High Throughput di Biomateriali

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Sintesi combinatoria di e High-throughput di rilascio di proteine ​​da film polimerico e Biblioteche nanoparticelle

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocollo per la relativa valutazione idrodinamica del Tri-volantino Polymer Valvole

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Manufacturing Of Robust Natural Fiber Preforms Utilizing Bacterial Cellulose as Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose and short sisal fibers are dispersed into a water suspension containing bacterial cellulose. The fiber and nanocellulose suspension is then filtered (using vacuum or gravity) and the wet filter cake pressed to squeeze out any excess water, followed by a drying step. This will result in the hornification of the bacterial cellulose network, holding the loose natural fibers together.
Our method is specially suited for the manufacturing of rigid and robust preforms of hydrophilic fibers. The porous and hydrophilic nature of such fibers results in significant water uptake, drawing in the bacterial cellulose dispersed in the suspension. The bacterial cellulose will then be filtered against the surface of these fibers, forming a bacterial cellulose coating. When the loose fiber-bacterial cellulose suspension is filtered and dried, the adjacent bacterial cellulose forms a network and hornified to hold the otherwise loose fibers together.
The introduction of bacterial cellulose into the preform resulted in a significant increase of the mechanical properties of the fiber preforms. This can be attributed to the high stiffness and strength of the bacterial cellulose network. With this preform, renewable high performance hierarchical composites can also be manufactured by using conventional composite production methods, such as resin film infusion (RFI) or resin transfer molding (RTM). Here, we also describe the manufacturing of renewable hierarchical composites using double bag vacuum assisted resin infusion.

We present a novel method of manufacturing rigid and robust short natural fiber preforms using a papermaking process. Bacterial cellulose acts simultaneously as the binder for the loose fibers and provides rigidity to the fiber preforms. These preforms can be infused with a resin to produce truly green hierarchical composites.

Produzione robusta fibra naturale preforme Utilizzando batterica cellulosa come Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant adhesion strength than commercial tissue adhesives. Medical adhesives have attracted great attention as potential alternative tools to sutures and staples due to their convenience in usage with minimal invasiveness. Although there are several protocols for developing tissue adhesives including those commercially available such as fibrin glues and cyanoacrylate-based materials, mostly they require a series of chemical syntheses of organic molecules, or complicated protein-purification methods, in the case of bio-driven materials (i.e., fibrin glue). Also, the development of surgical glues exhibiting high adhesive properties while maintaining biodegradability is still a challenge due to difficulties in achieving good performance in the wet environment of the body. We illustrate a new method to prepare a medical glue, known as TAPE, by the weight-based separation of a water-immiscible supramolecular aggregate formed after a physical mixing of a plant-derived, wet-resistant adhesive molecule,&#160;Tannic Acid (TA), and a well-known biopolymer, Poly(Ethylene) glycol (PEG). With our approach, TAPE shows high adhesion strength, which is 2.5-fold more than commercial fibrin glue in the presence of water. Furthermore, TAPE is biodegradable in physiological conditions and can be used as a potent hemostatic glue against tissue bleeding. We expect the widespread use of TAPE in a variety of medical settings and drug delivery applications, such as polymers for muco-adhesion, drug depots, and others.

We describe the simplest protocol to prepare biodegradable medical glue that has an effective hemostatic ability. TAPE is a water-immiscible supramolecular aggregate prepared by mixing of tannic acid, a ubiquitous compound found in plants, and poly(ethylene) glycol, yielding a 2.5 times greater water-resistant adhesion compared with commercial fibrin glue.

TAPE: Biodegradabile Una Hemostatic Glue Ispirato da un composto Ubiquitous nelle piante per applicazioni chirurgiche

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Sustained Administration of &amp;#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets &lt;em&gt;Ex Vivo&lt;/em&gt; Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.