Questo protocollo è significativo perché concentra vescicole extracellulari, veicoli elettrici, attraverso una combinazione di tecnologie, consentendo al contempo la separazione dei virioni dai veicoli elettrici. Questo metodo massimizza il recupero dell'EV al di sopra dell'attuale gold standard di ultracentrifugazione per l'analisi multipla a valle e la caratterizzazione di prep EV senza virus. Questo protocollo è ideale per lo studio di EV e infezioni virali.
Questo metodo può essere adattato ad altri sistemi virali, come HTLV, Ebola, Zika e altro ancora. Mi aspetterei che un utente per la prima volta di questo metodo lotta con la preparazione delle nanoparticelle, quindi ti consigliamo di seguire attentamente le nostre specifiche. Potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione, a seconda del sistema.
La dimostrazione visiva di questo metodo è importante per illustrare il flusso di lavoro complessivo e le sfumature del protocollo, che ridurranno tempi ed errori per gli utenti per la prima volta. Inizia preparando il supernatante della coltura da cellule infette o trasfette. Coltura circa 10 millilitri di cellule log tardive per cinque giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, assicurandosi che tutti i reagenti medi siano liberi da vescicole extracellulari.
Quando la coltura è pronta, pellet le cellule per centrifugazione a 3.000 volte G per cinque minuti e scartare il pellet. Filtrare il supernatante con un filtro sterile da 0,22 micrometri e raccogliere il filtrato in un tubo pulito. Aggiungere un volume uguale di reagenti di precipitazione PEG al filtrato e invertire il tubo più volte per mescolare.
Incubare la miscela a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela a 1500 volte G per 30 minuti, per produrre una vescicola extracellulare eterogenea, o EV, pellet. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 150-300 microlitri di 1X PBS, senza calcio e magnesio.
Mantenere il pellet sul ghiaccio, mentre si prepara un gradiente di densità. Preparare il mezzo gradiente di densità iodixanolo con 11 frazioni di densità, che vanno dal sei al 18% di iodixanolo, come descritto nel manoscritto. Mescolare ogni tubo vortice e sovrapporre le frazioni di densità in un tubo ultracentrifugo a secchio oscillante pulito e asciutto.
Aggiungere il pellet EV ri-sospeso nella parte superiore della sfumatura stratificata e ultracentrifugare il tubo a 10.000 volte G e quattro gradi Celsius per 90 minuti. Trasferire con cura ogni frazione dal tubo ultracentrifugo a un nuovo tubo di microcentrifugo. Preparare un liquame al 30% di nanoparticelle per l'arricchimento delle frazioni EV, mescolando volumi uguali di NT80, NT82 e 1X-PBS.
Vortice la miscela di nanoparticelle per garantire omogeneità. Aggiungere 30 microlitri del liquame ad ogni frazione di densità e mescolare tubazione o invertire i tubi. Il passaggio più critico è l'aggiunta dei nano-articoli per concentrare gli EV, seguendo la separazione del gradiente di densità.
Senza questo, il recupero dell'EV è scarso. Ruotare la nanoparticella contenente frazioni di densità durante la notte, a quattro gradi Celsius. Quindi centrifugare le frazioni di densità a 20.000 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Scartare il liquido e lavare il pellet EV due volte con 1X-PBS. Per preparare il pellet per l'isolamento dell'RNA, sospenderlo di 50 microlitri di acqua autoclavata, deionizzata, filtrata e trattata con depsy, secondo le indicazioni manoscritte. L'RNA può quindi essere isolato, utilizzando un kit commerciale.
Per l'analisi con elettroforesi gel, sospendere di nuovo il pellet in 15 microlitri di tampone Laemmli. Riscaldare il campione a 95 gradi Celsius per tre minuti. Ripetere il passaggio di riscaldamento altre due volte, vortice delicatamente e filatura del campione tra i cicli di calore.
Centrifugare il campione per 15 secondi a 20.000 volte G e caricare il supernatante direttamente sul gel. Per ottenere i migliori risultati, limitare la quantità di particelle caricate sul gel ed eseguito a 100 volt, per evitare che eventuali nanoparticelle caricate entrino nel gel. Le precipitazioni PEG consentono un recupero ev significativamente più efficiente rispetto alla tradizionale ultracentrifugazione.
Quando si utilizzano 10 millilitri di coltura, questo approccio si traduce in una resa circa 500 volte superiore rispetto all'ultracentrifugazione. Questo approccio si traduce anche in una maggiore efficienza di isolamento degli esosomi, che è evidente attraverso livelli più elevati di proteine marcatori esosomi. L'analisi western PLA mostra, un aumento di 3000 volte del CD81, un aumento di quattro volte del CD63 e un aumento di 40 volte del CD9.
Inoltre, questo protocollo consente studi a valle dei meccanismi mediati dall'EV nell'infezione da HIV1, isolando i veicoli elettrici dalle verioni. L'analisi del PLA occidentale mostra che gli EV si trovano in tre popolazioni frazionarie. Mentre il virus è presente solo in due di loro.
L'infrazione di EV da 10,8 a 12 è priva di contaminazione da virus. La cosa più importante da ricordare è che le nanoparticelle sono cruciali per un arricchimento ottimale dell'EV. La loro aggiunta è d'un must.
Molti saggi a valle, come western blot, PCR, pure diomech analysis by mass spectrometry in test cellulari a base di piastre possono essere eseguiti. Questi consentono studi di caratterizzazione, meccanicistici e/o funzionali. Questa tecnica consente studi specifici che esaminano il carico e la funzionalità dell'EV senza contaminare lo sfondo virale.
Ciò fornisce una base per lo studio dei veicoli elettrici nella patogenesi e nello sviluppo di potenziali terapie. Per superare i limiti di questa tecnica e applicare la preparazione e l'isolamento dell'EV a grandi volumi, si consiglia l'uso di sistemi avanzati, come la filtrazione del flusso tangenziale. Lo strumento più pericoloso da usare è l'ultracentrifugo, durante la separazione del gradiente di densità.
Assicurarsi che tutti i tubi di centrifuga pesino allo stesso modo, per evitare squilibri e potenziali guasti al rotore.
