I coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare sono strumenti importanti per l'analisi della dinamica degli organelli e delle cellule fungine viventi. I nostri protocolli forniscono un background teorico essenziale e linee guida pratiche per l'applicazione di una selezione di questi coloranti come macchie veramente vitali. Il punto chiave per questo è utilizzare concentrazioni di coloranti molto basse che non causano artefatti cellulari legati alla saturazione o alla tossicità del colorante, fornendo allo stesso tempo buoni rapporti segnale/rumore per l'imaging di cellule vive di alta qualità e a lungo termine.
Con i colleghi del Dipartimento di Medicina Nucleare dell'università medica, abbiamo recentemente utilizzato queste tecniche di colorazione per sviluppare un nuovo approccio per la diagnosi dell'aapergillosi guidata dall'immagine. La capacità di monitorare le strutture della membrana e della parete cellulare in tempo reale è stata fondamentale per determinare la dinamica di assorbimento del composto farmacologico sperimentale. Per iniziare questa procedura, ottenere prima una precultura preparata.
Usa un bisturi steril per tagliare un piccolo blocco di agar che trasporta micelio non sporulante dal bordo della colonia della precoltura. Posizionare il blocco di agar al centro di una piastra media fresca e solida per inoculare la coltura sperimentale. Incubare la coltura sperimentale in base allo stadio di sviluppo destinato ad essere incubato.
La preparazione del campione è piuttosto delicata e l'ottimizzazione delle impostazioni di acquisizione delle immagini è piuttosto complessa. La dimostrazione visiva di entrambe le procedure accompagnata da una spiegazione verbale facilita notevolmente la replicabilità. Per montare i campioni, tenere pronta una copertura in vetro pulita da 24 per 60 millimetri e aggiungere al centro 18 microlitri di media minima liquida o soluzione fisiologica di sale.
Aggiungere due microlitri della soluzione di lavorazione del colorante micromolare preparata al liquido al centro dello slittamento del coperchio e mescolare bene tubazione su e giù più volte evitando la produzione di bolle d'aria. Usando un bisturi pulito, ritaglia un campione di 15 per 15 millimetri dalla periferia della colonia e posizionalo verticalmente accanto alla goccia media sullo scivolo di copertura. Utilizzare il bisturi per sostenere il bordo superiore del blocco e un dito per tenere il lato posteriore del blocco in posizione.
Quindi, abbassare lentamente il lato portando il micelio sul liquido. Montare il campione preparato sullo stadio del microscopio. Per prima cosa, regola le impostazioni di acquisizione delle immagini di base per acquisire dinamiche permanenti nelle singole ife come delineato nel protocollo di testo.
Per i test di assorbimento dell'endocitosi, consultare la figura uno e la tabella uno del protocollo di testo per identificare le migliori impostazioni di eccitazione ed emissione per FM 143 o FM 464 disponibili sul sistema di microscopia e regolare queste impostazioni nel sistema di conseguenza. Avviare la registrazione delle immagini utilizzando le impostazioni regolate in precedenza e valutare i risultati. Quindi, ottimizza le impostazioni di acquisizione dell'immagine sulla risoluzione spaziale e temporale necessaria per catturare l'aspetto della membrana plasmatica o della dinamica dell'endocitosi su cui si concentra l'esperimento.
Per la dinamica della parete cellulare, consultare la figura quattro e la tabella uno del protocollo di testo per identificare le migliori impostazioni di eccitazione ed emissione per il colorante a parete cellulare applicato e regolare di conseguenza le impostazioni sul sistema di microscopia. Avviare la registrazione delle immagini utilizzando le impostazioni regolate in precedenza e valutare i risultati. Quindi, ottimizza le impostazioni di acquisizione dell'immagine sulla risoluzione spaziale e temporale necessaria per catturare l'aspetto della morfogenesi della parete cellulare su cui si concentra l'esperimento.
Oltre a visualizzare solo i processi cellulari, l'imaging a cellule vive consente l'estrazione di informazioni quantitative dai dati registrati. In un esempio dei test di assorbimento FM 464, i campioni fungini vengono coltivati come colonie e montati con il metodo del blocco di agar invertito. I test hanno identificato difetti nell'organizzazione spazio-temporale dell'endocitosi nella destiezione genica e nei mutanti gene che esprimono troppo la proteina specifica fungina SFP 2 del trichoderma atroviride.
Esempi di co-colorazione FM 464 di proteine di fusione fluorescenti destinate a compartimenti endocitici sono mostrati qui. Questa co-colorazione viene utilizzata per mettere in relazione la distribuzione subcellulare delle due proteine transmembrana taggate proteine transmembrana con proteine fluorescenti verdi potenziate, SFP 2 e GPR 1, con la via endocitica nel trichoderma atroviride. Un esempio di co-colorazione FM 464 per l'identificazione delle differenze morfogenetiche mostra che questa co-colorazione consente un'ulteriore relazione della dinamica di localizzazione subcellulare della proteina complessa bud-6 etichettata in modo farinoso per porre fine ad alcuni processi dipendenti dal traffico come la formazione di setti e la crescita della punta ifale polarizzata.
Caratterizza anche le differenze nell'organizzazione subcellulare e nell'architettura ifale tra tipo selvaggio e ceppi mutanti di neurospora crassa. La colorazione rappresentativa della parete cellulare mostra che le diverse proprietà di interazione del bianco calcofluoro, della flavina solofenile e del rosso congo con polimeri della parete cellulare evidenziano differenze morfogenetiche tra il mutante delta SFP 2 e il ceppo di tipo selvaggio del trichoderma atroviride. L'aumento dello stress della parete cellulare inflitto da elevate concentrazioni di colorante si verifica più rapidamente ed è più pronunciato nel mutante rispetto al tipo selvaggio.
Inoltre, le stesse immagini consentono la quantificazione delle differenze morfogenetiche per quanto riguarda il diametro ifo e la distanza settale tra entrambi i ceppi. Il monitoraggio rappresentativo in tempo reale della biosintesi della parete cellulare indica che la bassissimo concentrazione di bianco calcofluoro previene la saturazione della parete cellulare con molecole coloranti e consente il monitoraggio quantitativo in tempo reale della biosintesi della parete cellulare. Ciò rivela che la deposizione di nuovo materiale della parete cellulare non è uniforme, ma risponde molto rapidamente alle sollecitazioni fisiche localizzate derivanti dallo spostamento relativo di una cellula sull'attaccamento da cellula a cellula prima della dermalinfusione nella neurospora crassa.
Meno è di più. Utilizzare il meno colorante possibile per evitare interferenze del marcatore fluorescente con i processi cellulari. Seguendo questa procedura, il recupero della farinescenza dopo esperimenti di foto-sbiancamento potrebbe essere eseguito per quantificare la cinetica di trasporto e biogenesi.
L'introduzione pionieristica della colorazione delle pareti cellulari e di membrana nei funghi filamentosi all'inizio del millennio ha letteralmente rivoluzionato il modo in cui guardiamo i funghi. Il bianco calcofluoro può causare irritazioni agli occhi ed è un cancerogeno classificato. Il rosso Congo è cancerogenico e teratogeno, quindi si prega di indossare la protezione degli occhi e della pelle durante la manipolazione di questi coloranti.
