Questo protocollo facilita l'osservazione diretta di vari cambiamenti fenotipiche a livello di singola cellula e consente il monitoraggio continuo della localizzazione proteica e dei tempi di espressione genica. Il principale vantaggio della microscopia a fluorescenza è che è un metodo semplice per monitorare vari processi biologici, come la divisione cellulare e i cambiamenti della morfologia cellulare nelle cellule vive. Assicurati di prestare particolare attenzione al protocollo di preparazione del campione e di esplorare il software del microscopio per essere in grado di individuare le impostazioni e le opzioni elencate in questo protocollo.
Una rappresentazione visiva di questo protocollo è fondamentale perché consente agli utenti di guardare e apprendere i passaggi significativi della tecnica mentre impostano i propri esperimenti. Inizia etichettando un'aliquota da cinque a 50 microlitri della coltura cellulare di interesse con un colorante di colorazione a membrana appropriato e aggiungendo cinque microlitri delle cellule batteriche macchiate su un foglietto di copertura sul fondo di un piatto di coltura inferiore in vetro da 35 millilitri. Posizionare una lastra di agarosio di 11 millimetri di diametro sul campione e toccare delicatamente per assicurarsi che la lastra sia piatta contro lo scivolamento del coperchio.
Quindi aggiungere circa cinque microlitri d'acqua intorno allo scivolo di copertura per evitare che il tampone di agarosio si asciughi e lasciare che il piatto di coltura equilibra alla temperatura all'interno della camera di incubazione di un microscopio a deconvoluzione ad alta risoluzione per 15-20 minuti. Per immaginere il campione, utilizzare la manopola di messa a fuoco di regolazione grossolana per assicurarsi che l'obiettivo sia completamente abbassato prima di inizializzare il microscopio all'interno del software del microscopio. Inserire una goccia di 1.517 olio indice di rifrazione nell'obiettivo di immersione dell'olio 100x e trasferire il piatto inferiore di vetro contenente il campione nella bara dell'alloggiamento in metallo.
Far scorrere delicatamente il piatto nel morsetto del palco e utilizzare la manopola di regolazione grossolana per alzare l'obiettivo fino a quando l'olio non entra in contatto con il fondo di vetro del piatto. Utilizzare l'oculare e la manopola di regolazione fine per mettere a fuoco il campione e passare alla modalità Fotocamera. Nel software di imaging della finestra Risolvi 3D selezionare l'icona Progettazione/Esecuzione esperimento.
Verrà visualizzata una nuova finestra di dialogo intitolata Esperimento progettazione/esecuzione. Aprite le schede Progettazione (Design) e Se sezione (Sectioning) nella finestra di dialogo per impostare il numero di pile Z e lo spessore del campione. Per misurare lo spessore delle celle del campione, regolate in modo incrementale il piano Z utilizzando le frecce su e giù nella finestra di dialogo Risolvi 3D, rendendo il punto in cui le celle escono dallo stato attivo come limiti superiore e inferiore per l'acquisizione di immagini.
Dopo aver regolato la trasmissione percentuale dell'intensità della luce e la durata dell'esposizione per i singoli canali selezionati nella finestra di dialogo Risolvi 3D, fate clic su Elenco punti (Point List) per aprire l'elenco dei punti. Nelle schede Progettazione e Time Lapse selezionare la casella di controllo Time Lapse e immettere i parametri time lapse. Selezionare l'opzione Dell'elenco Punto di visita e immettere i punti da inserire nella casella di testo, separando i punti da virgole o trattini per sequenze complete.
Quindi modificare i nomi dei file e i percorsi dei file nella scheda Esegui e selezionare Riproduci nella finestra di dialogo Inizia esperimento per avviare l'esperimento. Al termine dell'analisi, aprite i file di immagine RAW di interesse in un programma di deconvoluzione appropriato e selezionate la scheda Processo (Process) e Deconvolve (Deconvolve). Eseguire qualsiasi sottrazione manuale di rumore di fondo e regolazione del contrasto della luminosità in uno o tutti i canali di lunghezza d'onda, se necessario, prima di salvare l'immagine come file TIFF.
Per la quantificazione della lunghezza delle celle, aprire i file di immagine deconvoluti nel software fornito dal produttore o nel software di imaging libero, ad esempio ImageJ, e aprire la scheda Strumento. Quindi selezionate Misura distanze (Measure Distances) e fate clic con il pulsante sinistro del mouse sui punti iniziale e finale del file di immagine desiderato per misurare la lunghezza della cella. Per la quantificazione del segnale fluorescente, selezionare Ispezione dati.
Disegnare una casella con l'opzione Colonna/Riga impostata sulla dimensione specifica di interesse e selezionare l'area con il segnale da quantificare. L'aggiunta di xilosio per indurre un ceppo GGS 8 si traduce in un fenotipo a sei cellule. Mentre i controlli vettoriali vuoti appaiono simili alle celle di controllo coltivate in assenza di induttore.
La sovrapproduzione di staph aureus gpsB interrompe la divisione cellulare in B.subtilis misurata dalla microscopia time lapse e dalla quantificazione della lunghezza cellulare. Inoltre, i modelli di localizzazione di FtsZ o di una delle proteine associate a questa proteina possono essere usati da un reporter per studiare e /o identificare nuovi composti antimicrobici attraverso l'imaging time lapse e la quantificazione della lunghezza cellulare. Assicurarsi di utilizzare un olio con l'indice di rifrazione appropriato in quanto l'indice di rifrazione può cambiare a seconda della temperatura utilizzata per l'imaging.
La deconvoluzione può essere eseguita se l'utente desidera rimuovere il rumore fuori fuoco e può anche essere eseguita l'analisi dei dati che coinvolge la quantificazione del segnale fluorescente e le misurazioni della lunghezza e della larghezza delle celle.
