Questo protocollo facilita analisi quantitative su piccola o grande scala del contenuto lipidico di stoccaggio cellulare in una varietà di specie di lievito e lo fa in modo imparziale e standardizzato. La tecnica consente la rapida elaborazione di immagini microscopiche e fornisce output quantitativi dettagliati per confrontare facilmente campioni come vari mutanti e cellule coltivati in diverse condizioni. Per iniziare, seguire il protocollo di testo di accompagnamento per preparare le soluzioni di colorazione, i supporti di coltura e le celle.
Assicurarsi che le cellule siano sane e nella fase di crescita desiderata prima di eseguire l'esperimento. Preparare quindi un coperchio del microscopio per ogni campione da imaged. Stendere un microlitro di soluzione di rivestimento scorrevole su un coverslip pulito utilizzando il lato lungo di una punta di pipetta posizionata orizzontalmente.
Lasciare asciugare completamente la soluzione di rivestimento, quindi conservare i copricapo in un ambiente privo di polvere. Successivamente, misurare le densità ottiche delle colture cellulari e, affinché le colture vengano analizzate nella stessa fase di crescita, cercare di raggiungere valori simili tra tutte le colture testate per garantire condizioni sperimentali comparabili. Quindi, pipettare un millilitro della coltura cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Solo per le celle S.cerevisiae, aggiungere cinque microlitri della soluzione di rivestimento scorrevole anche al tubo. Quindi, vortice brevemente tutti i tubi di microcentrifugo e incubarli a 30 gradi Celsius con tremori per cinque minuti. Quindi, aggiungere un microlitro della soluzione di colorazione lipidica ad ogni aliquota di coltura e vortice brevemente.
Quindi, aggiungere 10 microlitri della soluzione di visualizzazione dei limiti delle celle e vortice brevemente una seconda volta. Raccogliere le cellule centrifugandole a 1.000 volte la gravità per tre minuti a temperatura ambiente. Al termine della rotazione, rimuovere 950 microlitri dal supernatante e rimescolare le celle nel supernatante rimanente utilizzando una pipetta.
Successivamente, pipettare due microlitri della sospensione cellulare densa su un coverslip rivestito di letta. Quindi, posizionare il coverslip su una diapositiva del microscopio pulito per formare un monostrato cellulare e procedere alla microscopia il più rapidamente possibile per ridurre al minimo gli artefatti nell'imaging. La configurazione del microscopio richiede lunghe esposizioni a forti sorgenti luminose che potrebbero causare danni al campione e risultati di inclinazione.
Pertanto, impostare le condizioni di imaging utilizzando una diapositiva campione dedicata che non verrà ulteriormente utilizzata per la quantificazione delle goccioline lipidiche. Posizionare il campione dedicato sullo stadio di una configurazione del microscopio a contrasto di fase o di interferenza differenziale e concentrarsi sulle celle. Nel software del microscopio, impostare le impostazioni dello stack Z in modo che si esclaccino sull'intero volume cellulare.
La distanza verticale totale dipende dalla dimensione della cella e il numero di fette ottiche dipende dall'apertura numerica dell'obiettivo. Quindi, impostare lo stato attivo per spostarsi rispetto al piano focale centrale. Per immagini le goccioline lipidiche, impostare sperimentalmente l'intensità della luce e il tempo di esposizione nel canale verde.
Sii cauto durante l'imaging, poiché BODIPY è un fluorocromo molto luminoso che può essere rapidamente fotoliciato. Inoltre, ridurre al minimo il tempo di esposizione per evitare la sovrasaturazione. Cattura prima di passare al canale blu lo Z-stack a canale verde completo per evitare di sfocare le goccioline lipidiche mobili.
Per i limiti delle celle dell'immagine, impostare sperimentalmente l'intensità della luce e il tempo di esposizione nel canale blu. Se possibile, impostare e utilizzare un flusso di lavoro sperimentale automatizzato nel software di controllo del microscopio per facilitare l'imaging di più campioni in condizioni standardizzate. È importante sottolineare che tutte le immagini devono essere acquisite utilizzando le stesse impostazioni per consentire un confronto appropriato tra i campioni.
Una volta ottimizzate le condizioni di imaging, concentrati sulle celle e immaginile sia nei canali verde che in quello blu. Immagine di più campi di visualizzazione per esempio per ottenere dati robusti e rappresentativi. Salvare le immagini Z-stack del canale blu e verde come file TIFF multilivello a 16 bit.
Assicurati di includere le parole verde o blu nei nomi di file corrispondenti. Apri immagini microscopiche in ImageJ e rimuovi tutti gli stack di immagini contenenti un numero considerevole di celle che si sono spostate durante l'acquisizione. Questi appaiono in diverse posizioni nelle singole sezioni Z.
Quindi, rimuovere eventuali pile di immagini contenenti particelle non cellulari altamente fluorescenti nel canale blu. Ciò è spesso causato da sporcizia sulla superficie di imaging o impurità nel mezzo di coltivazione e può interferire con il rilevamento di cellule nelle loro vicinanze. Inoltre, rimuovere eventuali pile di immagini contenenti una grande percentuale di celle morte.
Queste immagini mostrerà cellule con aumento della fluorescenza blu rispetto alle cellule vive. Mentre la presenza di alcune cellule morte nel campione in genere non è un problema e queste cellule vengono automaticamente scartate durante l'analisi, alcune cellule morte o morenti possono occasionalmente essere riconosciute come cellule vive dall'algoritmo di segmentazione e quindi distorcere i risultati riportati. Per iniziare l'analisi in MATLAB, create innanzitutto una cartella principale e copiate tutti gli script MATLAB in questa posizione.
Creare quindi sottocartelle con i nomi delle varie specie di lievito e copiare le rispettive immagini TIFF in queste posizioni. Avviare MATLAB, aprire lo script MAIN. m, ed eseguire lo script.
Nel menu, selezionare le specie di lievito da analizzare e iniziare l'elaborazione delle immagini. Ispezionare ed elaborare i file di output come richiesto utilizzando un editor di fogli di calcolo o un pacchetto statistico. Il flusso di lavoro produce file CSV separati da punto e virgola e file TIFF segmentati con oggetti cellulari rilevati e goccioline lipidiche.
Di seguito sono riportate le cellule S.pombe di tipo selvatico coltivate nel complesso mezzo YES o nel mezzo EMM definito. Rispetto alle cellule coltivate nel mezzo SI, nel mezzo EMM sono state rilevate meno goccioline lipidiche e una maggiore intensità di colorazione per unità di volume cellulare. Inoltre, le singole goccioline lipidiche formate nel mezzo EMM erano più grandi e mostravano una maggiore intensità di colorazione totale.
Ciò è in accordo con i precedenti risultati dell'aumento del contenuto lipidico immagazzinato nelle cellule coltivate in EMM. Successivamente, queste immagini mostrano cellule S.japonicus di colture esponenziali e stazionarie cresciute in mezzo SI. Le cellule che entrano in fase stazionaria hanno mostrato un numero marcatamente diminuito di goccioline lipidiche per unità di volume cellulare, mentre l'intensità della fluorescenza delle goccioline lipidiche normalizzata in volume è leggermente diminuita tra le due condizioni.
Le prime goccioline lipidiche in fase stazionaria erano tipicamente di dimensioni moderatamente più grandi e avevano un'intensità di fluorescenza totale moderatamente più elevata rispetto alle goccioline provenienti da cellule in crescita esponenziale. Nelle cellule di S.cerevisiae cresciute fino alla fase esponenziale rispetto a quella stazionaria, le cellule stazionarie contenevano un po 'meno goccioline lipidiche per unità di volume rispetto alle cellule in crescita esponenziale. Tuttavia, la loro intensità di fluorescenza delle goccioline normalizzata in volume è quasi raddoppiata.
Questo forte aumento del contenuto complessivo di goccioline lipidiche è dovuto all'intensità di fluorescenza molto più elevata e al volume delle singole goccioline lipidiche in fase stazionaria. Seguendo questa procedura, i dati di output possono essere aggregati in un pacchetto statistico come R per creare grafici di risultati riassunti ed eseguire test statistici su eventuali differenze osservate nel contenuto di goccioline lipidiche. In linea di principio, la pipeline di elaborazione delle immagini può essere utilizzata per l'analisi del contenuto di goccioline lipidiche in altri microrganismi o per analizzare altre strutture subcellulari simili a punti.
