Questo protocollo può essere utilizzato per la biosintesi delle cercosporine attraverso la fermentazione microbica, che a sua volta può essere utilizzata per sintetizzare eterocicli contenenti azoto in condizioni verdi e lievi. Un vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzata come ponte tra i metodi di fermentazione microbica e i processi sintetizzati organici. Gli eterocicli contenenti azoto non sono solo scheletri importanti per molti prodotti naturali con bioattività, ma sono precursori sintetici per molti prodotti agrochimici e farmaci.
A dimostrare la procedura con Philippe Icyishaka sarà Yan Zhang, un tecnico del mio laboratorio. Per la preparazione alfa-halo-N-acil-idrazone, pesare 10 millimolare di chetone e 10 millimolare di benzoil idrazina in un pallone. Aggiungere 20 millilitri di metanolo al pallone e dotare il pallone di una barra di agitazione e di un tappo di gomma.
Iniettare lentamente 250 microlitri di acido cloridrico nella miscela e incubare il pallone in aria a temperatura ambiente. Dopo un'ora, raccogliere il precipitato dopo la reazione per filtrazione e lavare il prodotto con acetone. Quindi asciugare il precipitato sotto vuoto e identificare il prodotto da NMR.
Per preparare la cercosporina, caricare un pallone agitare da tre litri con un litro di mezzo S-7 e inoculare il ceppo che produce cercosporina nel pallone agitare. Coltura la miscela in condizioni di luce a 135 giri al minuto e 25 gradi Celsius per due settimane. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pompa per vuoto per sottoformare il brodo di fermentazione alla filtrazione sottovuoto ed estrarre il pellet e il supernatante separatamente con tre volumi da 50 millilitri di diclorometano.
Raccogliere il pellet per l'essiccazione in un essiccatore congelatore e combinare le fasi organiche. Lavare le fasi organiche con acqua da due a tre volte e concentrare la soluzione sotto vuoto. Riassociare il residuo con metanolo analitico e filtrare il prodotto attraverso una membrana di microfiltrazione organica di 18 micrometri.
Quindi purificare la cercosporina con una colonna Sephadex LH-20 e identificare il prodotto da HPLC secondo protocolli standard. Per preparare 1, 2, 3-tiadiazolo, aggiungere l'intero volume dell'alfa-Halo-N-acil-hydrazone, un milligrammo di cercosporina, 27 milligrammi di tert-butossido di potassio e 39 milligrammi di tiocianato di potassio in un tubo Schlenk da 10 millimetri dotato di un tappo di gomma e una barra di agitazione. Eliminare il tubo di Schlenk con ossigeno tre volte prima di iniettare due millilitri di acetonitrile secco nel tubo.
Sottosostire il tubo a un LED blu da cinque watt dal basso per 16 ore prima di lavarsi quattro volte con 15 millilitri di soluzione di cloruro di sodio saturo. Dopo l'ultimo lavaggio, unire la fase acquosa ed estrarre di nuovo la fase acquosa con quattro volumi da 15 millilitri di acetato di etile. Unire la fase organica e asciugare con solfato di sodio anidro.
Rimuovere il solvente con un evaporatore sottovuoto. Per purificare il prodotto con cromatografia a strato sottile, disegnare una linea retta sulla piastra di silice e aggiungere il prodotto disciolto alla linea. Mettere la piastra di silice nel cilindro di cromatografia con 10 a uno PE a EA. Dopo, sciogliere la silice in DCM.
Rimuovere la silice dal prodotto per filtrazione e asciugare il DCM con un evaporatore rotante. Quindi identificare il composto da NMR secondo il protocollo standard. Per preparare 1, 4, 5, 6-tetraidropiridazina, aggiungere l'intero volume dell'alfa-Halo-N-acil-hydrazone, 2,7 milligrammi di cercosporina e 195 milligrammi di carbonato di cesio in un tubo Schlenk da 10 millilitri dotato di tappo di gomma e una barra di agitazione.
Eliminare il tubo di Schlenk tre volte con azoto e iniettare due millilitri di acetonitrile in acqua nel tubo. Sottosostire il tubo di Schlenk a un LED blu da cinque watt dal basso per 16 ore seguito da quattro lavaggi con 15 millilitri di cloruro di sodio saturo per lavaggio. Unire la fase acquosa ed estrarre di nuovo la fase acquosa con quattro volumi da 15 millilitri di acetato di etile.
Unire la fase organica e asciugare con solfato di sodio anidro. Rimuovere il solvente con un evaporatore sottovuoto. Per purificare il prodotto con cromatografia a strato sottile, disegnare una linea retta sulla piastra di silice e aggiungere il prodotto disciolto alla linea.
Mettere la piastra di silice nel cilindro di cromatografia con 10 a uno PE a EA. Dopo, sciogliere la silice in DCM. Rimuovere la silice dal prodotto con filtrazione e asciugare il DCM con un evaporatore rotante. Quindi identificare il composto da NMR secondo il protocollo standard.
Questi risultati rappresentativi dimostrano come 4-aril-1, 2, 3-tiadiazoli e 1, 4, 5, 6-tetraidropiridazine possano essere comodamente sintetizzati da reazioni fotocatalitiche catalizzate da cercosporina da alfa-Halo-N-acil-idrazone. La procedura di acquisizione 4-aril-1, 2, 3-tiadiazoli è adatta per substrati che portano sia gruppi che donano elettroni che accettano elettroni nell'anello fenile, fornendo ai prodotti desiderati rese da moderate a buone. Ricorda sempre di usare azoto e ossigeno per due diverse categorie di reazioni.
