Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave nel campo dell'immunoterapia sulla valutazione della citotossicità delle cellule immunitarie contro le cellule tumorali della struttura 3D. I principali vantaggi di questo metodo sono che è semplice e combina una tecnologia di imaging avanzata e un saggio immunologico sensibile. Inizia lavando la linea cellulare del cancro colorettale di interesse con cinque millilitri di PBS e rimuovendo le cellule dal fondo del pallone con 0,5 millilitri di tripside per cinque minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo aver confermato il distacco al microscopio, neutralizzare l'enzima di dissociazione cellulare con 10 millilitri di mezzo completo e raccogliere le cellule per centrifugazione. Resostigliere il pellet in cinque millilitri di mezzo fresco completo per il conteggio e rimosogliere le cellule a una concentrazione di 1,5 volte 10 alla terza parte per millilitro. Quindi seminare 200 microlitri di cellule in ogni pozzo di piastra inferiore rotonda da 96 po 'e posizionare la piastra in un apparato di imaging automatizzato all'interno di un incubatore Celsius di 37 gradi con 5%CO2 e 95% di umidità.
Accedere al software di acquisizione dell'apparecchio e selezionare Pianifica per acquisire, Lanciare Aggiungi nave, Scansione nei tempi previsti e Crea nave nuova. Selezionare quindi il tipo di scansione Sferoide e selezionare i canali di interesse appropriati per il campo luminoso e la fluorescenza. Impostare l'ingrandimento su 10 volte e selezionare il modello di piastra e la sua posizione all'interno del cassetto dell'apparato di imaging.
Selezionare la posizione dei pozzi da imageare e immettere la descrizione dell'esperimento, inclusi il nome, il tipo di celle e il numero di celle. Per l'impostazione dell'analisi, selezionare Rinvia analisi fino a un secondo momento, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale e selezionare Imposta intervallo gruppo di scansione selezionato e impostare Aggiungi scansioni ogni quattro ore e Per un totale di 24 ore. Quindi impostare l'ora di inizio su almeno un'ora dopo l'incubazione nell'apparato di imaging automatizzato.
Per controllare l'avanzamento della crescita dello sferoide, ogni due giorni accedere al software di imaging e selezionare Visualizza scansioni recenti. Fate doppio clic sull'esperimento di interesse e selezionate Brightfield nel pannello Canali immagine. Quindi utilizzare lo strumento Measure Image Features per misurare il diametro degli sferoidi, aggiungendo 50 microlitri di mezzo completo per pozzo al quarto giorno per limitare eventuali effetti di evaporazione media.
Quando gli sferoidi raggiungono le dimensioni sperimentali appropriate, inclinare attentamente la piastra e utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere delicatamente 150 microlitri di mezzo completo da ogni pozzo senza disturbare gli sferoidi. Successivamente, sostituire il mezzo scartato con 50 microlitri di una soluzione da uno a 200 di Annexin V Red e posizionare la piastra in un incubatore di coltura cellulare per 15 minuti. Centrifugare le celle CAR CD19 T trasdotto in un tubo conico da 15 millilitri e rimosogliere il pellet in due millilitri di mezzo completo.
Dopo il conteggio, diluire le cellule a due volte 10 alla quinta colonna per millilitro di concentrazione media completa. Quindi aggiungere 100 microlitri di cellule CAR CD19 T a ciascun pozzo contenente sferoide e riportare la piastra all'apparato di imaging automatizzato. Nel software di acquisizione selezionare Pianifica per acquisire e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale di scansione.
Selezionare Modifica sequenza temporale e fare clic con il pulsante destro del mouse sul gruppo di analisi per eliminarlo. Fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale e selezionare Imposta intervallo gruppo di scansione selezionato e impostare Aggiungi scansioni ogni 1 ora e mezza e Per un totale di 24 ore. Quindi impostare l'ora di inizio dell'imaging su almeno un'ora dopo l'inizio dell'incubazione nell'apparato di imaging automatico e selezionare Salva scansioni programmate.
Per l'analisi automatica delle immagini, nel software di scansione selezionare Visualizza scansioni recenti e Analisi di avvio. Selezionate Crea nuova definizione analisi (Create New Analysis Definition) e tipo di analisi Sferoide (Sferroid) e impostate i canali immagine da analizzare. Seleziona almeno 10 immagini rappresentative e visualizza in anteprima la procedura di analisi predefinita sull'intero stack di immagini.
Modificate i parametri per la maschera a campo luminoso e visualizzate in anteprima lo stack di immagini, confermando che i parametri selezionati rilevano accuratamente gli sferoidi. Modificate i parametri per la maschera verde e visualizzate in anteprima lo stack di immagini per verificare che i parametri selezionati rilevino accuratamente gli sferoidi. Modificate i parametri per la maschera rossa e visualizzate in anteprima lo stack di immagini per verificare che i parametri selezionati rilevino accuratamente gli sferoidi.
Fai attenzione a ottenere il miglior segnale rispetto al rumore e alla sensibilità rispetto ai rapporti di specificità, tenendo presente che non sarai in grado di trovare una serie di parametri che permetteranno di catturare ogni evento in ogni momento. Quindi avviare l'analizzatore. Al termine dell'analisi, estrarre la misurazione dell'interesse e selezionare il file analizzato e l'opzione metriche del grafico.
Seleziona le metriche di interesse, la scansione e il pozzo. Fare clic su Esporta dati per estrarre le metriche selezionate in diversi formati di file. Quindi, per estrarre le immagini, selezionare il file analizzato e selezionare Esporta immagini e filmati.
L'espressione CD19 CAR sulle cellule T trasdotto e l'espressione CD19 sulle cellule tumorali colorettali trasdotto possono essere confermate dalla citometria a flusso. Qui, si può osservare il risultato di un tipico esperimento sferoide. A differenza delle cellule T finte, le cellule CAR T CD19 sono in grado di uccidere specificamente gli sferoidi derivati dalla linea delle cellule tumorali colorettali, diminuendo notevolmente il numero di cellule tumorali vive.
Il monitoraggio dell'evoluzione dei segnali verdi e rossi totali all'interno dei confini dello sferoide nel tempo rivela che poco dopo l'iniezione cellulare CAR T CD19, la dimensione degli sferoidi si restringe rapidamente man mano che il segnale di apoptosi aumenta rapidamente. Seguendo questa procedura, altri metodi come test di tossicità, test di migrazione cellulare o misurazioni della struttura sferoide possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive rispettivamente su screening farmacologico, motilità delle cellule T o formazione di sferoidi.
