I macrofagi associati al tumore svolgono ruoli importanti nel microambiente tumorale. Comprendere come le diverse mutazioni genetiche nelle cellule tumorali influenzino il reclutamento di macrofagi è fondamentale per progettare un trattamento personalizzato per i pazienti oncologici. Questo saggio fornisce un modo semplice e robusto per valutare l'interazione tra cellule tumorali e macrofagi in vitro.
Questo saggio può essere modificato per valutare le interazioni tra le cellule tumorali e altre cellule immunitarie in vitro. Per iniziare questa procedura, riscaldare il mezzo di cellule staminali privo di siero posizionandolo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Spruzzare la superficie del cappuccio di coltura tissutale con il 70% di etanolo e pulire la superficie spruzzata con tovaglioli di carta.
Successivamente spruzzare le bottiglie della soluzione di distacco di medie e celle con etanolo al 70% e pulirle con tovaglioli di carta. Trasferire le bottiglie pulite nel cappuccio di coltura tissutale. Recuperare la cellula tumorale e trasferirla nella cappa di coltura tissutale.
Aspirare il mezzo e lavare le cellule con 10 millilitri di PBS. Quindi aggiungere due millilitri di soluzione di distacco cellulare al pallone. Impostare il pallone nel cofano, controllando ogni minuto per vedere se le cellule tumorali si sono arrotondate per eccesso.
Una volta che le cellule tumorali si arrotondano, toccare delicatamente il lato del pallone per aiutare le cellule a staccarsi. Dopo questo, pipettare otto millilitri di mezzo cellulare privo di siero nel pallone e pipettare su e giù tre volte per mescolare. Trasferire questa sospensione cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Aspirare il supernatante. Quindi lavare le celle in 10 millilitri di PBS, assicurandosi di pipettare su e giù da tre a cinque volte per mescolare. Centrifugare le cellule a 200 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 10 millilitri di mezzo privo di siero. Pipetta su e giù da tre a cinque volte per mescolare. Mescolare 10 microlitri di questa sospensione cellulare con 10 microlitri di soluzione Trypan Blue.
Successivamente pipetta 10 microlitri del Trypan Blue e miscela cellulare in una diapositiva di conteggio, e utilizzare un contatore di cella automatico per quantificare il numero di cellule viventi. Utilizzare il mezzo cellulare privo di siero per regolare la densità cellulare a 2,5 per 10 alla quinta cella per millilitro. Quindi semina due millilitri delle cellule in ogni pozzo di un piatto di coltura a sei pozzi.
Allo stesso tempo, preparare sei pozzi con solo due millilitri di mezzo di cellule staminali privo di siero. Successivamente, incubare le piastre a sei pozzi a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 24 ore. Prima spruzzare la superficie del cappuccio di coltura tissutale con il 70% di etanolo e pulire la superficie spruzzata con tovaglioli di carta.
Successivamente spruzzare le bottiglie della soluzione di distacco di medie e celle con etanolo al 70% e pulirle con tovaglioli di carta. Trasferire le bottiglie pulite nel cappuccio di coltura tissutale. Dopo questo, recupera le piastre a sei pozzi dall'incubatore.
Pipettare con cura il supporto condizionato in tubi di centrifuga sterile da 15 millilitri e posizionare i tubi sul ghiaccio. Aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di distacco cellulare in ogni pozzo delle piastre a sei pozzi e controllare ogni minuto se le cellule tumorali si sono arrotondate per eccesso. Una volta che le cellule tumorali si arrotondano, toccare delicatamente il lato della piastra per aiutare a staccare le cellule.
Pipetta successiva 2,5 millilitri di mezzo di mantenimento delle cellule tumorali nel pozzo e pipetta su e giù tre volte per mescolare. Trasferire le cellule in un tubo di centrifuga sterile da 15 millilitri. Mescolare 10 microlitri di cellule con 10 microlitri di soluzione Trypan Blue e trasferire 10 microlitri di questa miscela nella diapositiva di conteggio.
Utilizzare un contatore di cellule automatico per quantificare il numero di cellule viventi e utilizzare il mezzo di cellule staminali privo di siero che è stato incubato a 37 gradi Celsius durante la notte per regolare il volume del supporto condizionato in base al numero di cellule. Filtrare il supporto condizionato attraverso filtri da 0,45 micrometri e posizionare il supporto condizionato sul ghiaccio. Per iniziare, riscaldare il mezzo IMDM in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Pulire la cappa di coltura tissutale con il 70% di etanolo e pulire la bottiglia di mezzo e trasportarla nel cappuccio come descritto in precedenza. Successivamente trasferire il pallone delle cellule MV-4-11 nel cofano. Pipetta 10 millilitri di cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Utilizzare Trypan Blue e un contatore di celle automatico per quantificare il numero di celle viventi come descritto in precedenza. Quindi centrifugare le cellule a 200 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare il supernatante e lavare le cellule con 10 millilitri di PBS.
Centrifugare di nuovo a 200 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule nel mezzo IMDM ad una densità cellulare finale di un milione di cellule per millilitro. Per prima cosa porta i materiali necessari a temperatura ambiente.
Aggiungere 250 microlitri delle celle MV-4-11 preparate ad ogni inserto. Aggiungere quindi 400 microlitri del mezzo o del mezzo condizionato solo alle camere inferiori della piastra da 24 pompoli, assicurandosi di aggiungere i campioni in triplice copia. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per quattro ore.
Quindi toccare delicatamente l'inserto sulla parete interna dello stesso pozzo e scartare l'inserto. Pipettare delicatamente le cellule nei pozzi su e giù tre volte per mescolare. Trasferire 225 microlitri di questa sospensione cellulare nei pozzi di una piastra da 96 po' con pareti nere adatta alla misurazione fluorescente.
Successivamente, diluire il colorante CyQUANT con tampone di lysis 4x con un rapporto da uno a 75. Vortice brevemente e girare verso il basso la soluzione. Trasferire 75 microlitri di questa soluzione in ogni pozzo della piastra da 96 pozzi e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
Utilizzando un lettore di lastre di fluorescenza, leggere la fluorescenza e analizzare i dati come delineato nel protocollo di testo. In questo studio, un saggio in vitro viene utilizzato per studiare l'interazione del macrofago tumorale. Campioni con alti valori di fluorescenza indicano che il supporto condizionato ha un'alta capacità di reclutare macrofagi.
A seconda delle esigenze sperimentali, è possibile includere controlli aggiuntivi. Ad esempio, si possono usare anticorpi neutralizzanti per trattare i mezzi condizionati per abolire la chemiotassi macrofagia e funzionare allo stesso modo. Si possono anche aggiungere chemiochine extra ai supporti condizionati, che fungono da controllo positivo.
È importante controllare le differenze di numero di cella per questo test perché diversi tipi di cellule possono crescere a velocità diverse. La conferma in vivo dei risultati in vitro è fondamentale. Si possono iniettare cellule tumorali nei topi e analizzare i tumori con citometria a flusso, immunosottenizione e CitoF per confermare i risultati.
